生物化学与分子生物实验课讲义.docVIP

实验一 SDS碱裂解法小量制备质粒 一、实验目的 1．掌握SDS碱裂解法小量制备质粒的原理和方法。 2．掌握高速离心机、微量移液器等常规仪器的正确使用。 二、实验原理 对培养的含有大量质粒的菌液，离心收集菌体，用含一定浓度葡萄糖的缓冲液悬浮菌体，采用碱性SDS裂解细菌的细胞壁，使质粒缓和释放出来。同时整个溶液的pH为12-12.5，使断裂成线性细菌染色体DNA变成单链、相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上，当液体的pH调至中性并有高浓度存在下，大部分蛋白质和细菌染色体形成沉淀，而共价闭环质粒DNA仍为可溶状态，离心获得含有大量质粒上清液，用RNA酶A处理除去RNA，用苯酚氯仿除去残留蛋白质，再利用核酸不溶于有机溶剂的性质，从而使其在适当浓度的亲水性有机溶剂中（乙醇、异丙醇、PEG8000）沉淀析出。 三、材料、试剂和仪器 1．试剂 GT116（含psiRNA质粒）菌种 LB液体培养基 溶液 I、溶液 II、溶液 III、无水乙醇、氯仿、异戊醇、Tris饱和酚、RNA酶A、TE、STE、卡那霉素（配方见附录） 2．仪器和材料 超净台、高速离心机、微量移液器、灭菌eppendorf管和tips、37℃摇床、旋涡混匀器 四、实验操作步骤 在超净台内从平板上挑取单菌落或用以其它方式保存的菌种接种于3ml LB培养基，在37℃培养15-18个小时。 向1 个2ml的离心管里加约1.5ml的菌液。