2-2测序.ppt

5 鸟枪测序法(shotgun sequencing)  大分子DNA被随机地“敲碎”成许多小片段，收集这些随机小片段并将它们全部连接到合适的测序载体（如M13噬菌体）；小片段测序完成后，根据重叠区计算机将小片段整合出大分子DNA序列。这就是所谓的鸟枪测序法。   将DNA大片段切割成小片段的三种方法： 限制性内切酶 超声波处理 DNA酶I降解(加Mn2+) 在这三种方法处理前， DNA的纯化非常重要，要去除载体DNA或仅由载体DNA产生的片段。 鸟枪法测序的缺点 随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加，造成重复测定，也易丢失某些序列，且数据处理分析工作量大。 高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误。 引物步移策略 将待测DNA片断克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸，从DNA片断的一端开始逐步进行序列测定，直至另一端为止。 克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备步骤，也减轻了数据分析工作量。 但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基顺序，才能合成适当的引物进行测序。 定向缺失克隆策略、染色体步查法等。 基因组测序 DNA测序不能从染色体进行，首先必须克隆化，构建基因组的物理图谱。 先构建片段DNA克隆(以YAC或BAC为载体)，并把克隆依染色体排序，这就是“染色体的克隆图”。依片段DNA克隆在染色体上所在的位置排序，可以得到相互重叠的一系列克隆，叫做“克隆重叠群”(contig)。选取有关的克隆进行DNA测序，就可以“拼装”出整个染色体或基因组的DNA序列。如果克隆片段太大仍不便于直接测序，则需通过亚克隆，构建更小的片段。 另外一种方法是对所有相互重叠的亚克隆进行测序，然后直接通过计算机程序根据其重叠部分进行“拼装”。 完整基因组的测序过程一般包括三个步骤： （1）建立克隆的物理图谱：如酵母人工染色体YAC（Yeast Artificial Chromosome）克隆、细菌人工染色体BAC（Bacterial Artificial Chromosome）克隆等； （2）利用鸟枪法（Shotgun Strategy）测定每个克隆的序列； （3）序列拼装和注释：当得到一段DNA序列之后，可以利用序列分析工具，进行序列的拼接；继而通过与数据库序列的比较，得到与该序列相关的信息，如基因、调控元件、重复区域等，进而对序列的生物学特性进行注释。 Sanger第一步：加入复制终止剂 思考题 第一节 1 什么是基因，基因的特点有哪些。 2 基因工程研究的主要内容或步骤 . 3 基因工程所以依赖的三大理论基础和三大技术基础分别是什么？ 4 简述基因工程研究发展史。 第二节 1 核酸的凝胶电泳基本原理及操作步骤 。 2 琼脂糖凝胶电泳的特点。 3 PCR技术的基本原理及特点。 4 PCR技术的五大基本要素是什么。 5 什么是引物，它有哪些要求。 6核酸分子杂交的步骤有哪些。 7简述Southern杂交的步骤。 8凝胶阻滞实验的原理及操作步骤。 DNaseⅠ足迹实验的原理及操作步骤 DNA核苷酸序列分析方法有哪些，其原理是什么。 肼： 又叫联氨（NH2.NH2），在碱性条件下，与胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（ C ）作用。再通过六氢吡啶的作用，使两个磷酸分子从糖片断上释放出来，从而导致在核苷酸位置上发生DNA的断裂。 盐存在的条件下，联氨同胸腺嘧啶（T）的反应便会被抑制，最终只发生胞嘧啶碱基特异的切割反应。 由此来区别C和C+T这两种化学反应。 硫酸二甲酯（(CH3O)2SO4） 一种碱性的化学试剂。 在它的作用下，DNA碱基环中的氮原子会发生甲基化反应，在中性的PH值环境中，可导致配糖键发生水解，使去碱基的糖-磷酸键十分微弱，在碱性条件下磷酸分子就能从DNA链上脱落，造成链的断裂。 鸟嘌呤（G）的N7腺嘌呤(A)的N3 4～10倍 在六氢吡啶的作用下，从脱氧核糖上移去2个磷酸分子，使DNA链在甲基化的鸟嘌呤G位点断裂。 CS载体系统：末端标记载体 核酸内切酶Th111 Ⅰ 特点： 1. 产生5’单碱基的突出末端，便于标记； 2. Th111 Ⅰ位点十分稀少； 3. 5’突出末端可以是G或A，也可以是T 或C，选择性强； 4. 在载体中具有两个Th111 Ⅰ位点，可对克隆在载体上的片断任何一段作选择性标记。 化学修饰法的优点： 1. 不需要体外酶切； 2. 只要有末端标记，无论单双链都可用来测序。