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Agarose Gel Electrophoresis 琼脂糖凝胶电泳 三、试剂与器材（Reagents and apparatus） 1. Agarose. 2. TBE [5 × stock solution 1 liter : 54 g Tris base, 27.5 g boric acid, 20ml 0.5 M EDTA, pH 8.0].实验室：TAE50× 3. 10 × loading buffer: 0.25% bromophenol blue, 40% sucrose in water. 实验室：碧云天 6× 4. Equipment: beaker, graduated cylinder, stir bar, microwave, Pan balance, comb, electrophoresis tank, and Electro-phoresis System , Ultraviolet transilluminator. 5. EB实验室：分装5mg/mL 四、实验步骤 Experimental Procedures Ⅰ. Preparation of the gel （凝胶的制备） 1.制备1％琼脂糖凝胶。称取0.5g琼脂糖，放人锥形瓶中，加入50mL的 1×TAE 缓冲液，放入微波炉加热至完全溶化，则为1％琼脂糖凝胶液。（由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号或称量质量，溶解后用三蒸水补足） 2.制胶器的安装 ①取多功能制胶器，洗净，晾干； ②将多功能制胶器放置于一水平位置，选择12×6cm制胶架，然后选择1.5mm 18teeth的梳子（最大加样量25μl）； ③加入电泳缓冲液 1× 至电泳槽中 3. 将熔化的琼脂糖凝胶液转入三角瓶中，然后加入EB 5μl。 4. 将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入所选择的制胶槽内，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面 注意不要形成气泡 。 5. 将所选择规格的梳子插入制胶架的定位槽中。 6. 待胶凝固后（30-60min），轻轻拔掉梳子，将凝胶盘从制胶槽中取出，放入电泳槽内。 Ⅱ. Loading DNA samples 加样 用移液枪缓慢将DNA样品垂直加入加样孔直至开口下方。 1.DNA samples ：4-5μl 2. Loading buffer 6X ：1μl 用移液枪滴于EP手套上，与DNA samples来回吹打混匀 3. DNA markers ：6μl Ⅲ.Gel（电泳） 1. 接通电泳槽与电泳仪的电源 注意正负极，DNA片段从负极向正极移动 。保持电压 60－80 V。实验室：120V左右 2. 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。（看情况而定） Ⅳ. Gel Interpretation （凝胶图像解释） The uncut DNA lane may have several bands in it. This occurs because the mobility of plasmid DNA in an agarose gel depends on its molecular conformation as well as its size in base pairs. Plasmid DNA can exist in any one of three major conformations: 未切割的质粒DNA在其泳道上也许会出现几个条带，之所以这样是由于质粒DNA在琼脂糖凝胶中的迁移距离是由其分子构象及其碱基对大小所决定的。质粒DNA以下列三种主要构象中的任何一种形式存在： Supercoiled -- plasmid is usually seen as a supercoil in a bacterial cell. This form of the plasmid will move the fastest through the gel due to its compact structure. 超螺旋——质粒在细菌细胞以超螺旋结构存在，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动速度最快。 Nicked--During plasmid DNA replication, topoisomer-ase I introduces a nick into one strand of the DNA helix and uncoils the plasmid. Physical shearing and enzymatic cleavage during plasmid isolation may also introduce nicks into the supe