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基因工程复习题思考题 基因工程绪论 1、基因工程的定义与特征。 定义：在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。 特征：1、具跨越天然物种屏障的能力。 2、 强调了确定的DNA片段在新寄主细胞中的扩增。 2、试述基因工程的主要研究内容。 1）、目的基因的分离 2）、DNA的体外重组（载体、受体系统等） 3）、重组DNA分子转移到受体细胞及其筛选 4）、基因在受体细胞内的扩增、表达、检测及其分析。 3、基因工程在食品工业上有何应用发展？ 主要是通过基因重组，使各种转基因生物提高生产谷氨酸、调味剂、酒类和油类等有机物的产率；或者改良这些有机物组成成分，提高利用价值。??? 基因工程操作的基本技术 DNA凝胶电泳中核酸分子分离的机理。 在碱性环境下，核酸分子带负电荷，在外加电场的作用下，分子在凝胶多孔性刚性滤孔中从负极向正极泳动，其中主要由于分子筛效应和电荷效应达到分离不同大小核酸分子的目的。 DNA凝胶电泳中影响电泳迁移率的因素主要有哪些？ 1）分子本身的影响 (分子的大小：小则快 (带电荷数：多则快 (分子构型：超螺旋解螺旋 2）电场：直流电场 (电压高则快 (电压太高则结果不准确 常用3~5V/CM 3）支持物介质 (种类：琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 (凝胶浓度: 浓度大，筛孔小，适合小分子电泳；浓度小，筛孔大，适合大分子电泳 4）电泳缓冲液 ( pH值：偏碱性，带负电荷 ( 离子浓度：离子浓度高( 电流大(发热快(胶溶解 (种类：TAE、TBE、 PCR的原理和主要反应过程，并分析影响PCR扩增的影响因素。 PCR原理：变性温度下， DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增。 影响PCR扩增的影响因素： §(1)Taq酶：常用1U/25μL (浓度低，扩增产物不够； (浓度高，非特异性扩增增加； (酶的活性； §(2)dNTP的浓度：常用100-200μmol/L，不能低于20μmol/L，特异性、保真性； §(3)模板：主要考虑纯度及使用量，对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个ng到100ng. §(4)引物浓度：0.1-0.5μmol/L之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体； §(5)Mg2+浓度：常用 0.5-2.5mmol/L； 影响：酶的活性、引物-模板退火、特异性 §(6)PCR反应程序设定：变性温度和时间、引物退火温度Tm与时间、引物延伸温度与时间和循环数 PCR引物设计的原则，若给一指定DNA序列并需要通过PCR扩增此序列，如何设计扩增引物？ 引物设计原则： 1、G+C含量45-55%； 2、Tm值高于55； 3、引物特异性； 4、引物扩增跨度； 5、是否形成引物二聚体 定量PCR的原理？Ct值的含义。 原理：通过实时检测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量及定性的分析。 初始模板量X0的对数值与C(T) 值之间呈线性关系：log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log N Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号开始由本底进入指数增长阶段时到达设定的域值时所经历的循环数（如后图所示，图仅供参考） 分子杂交的类型主要有哪些？探针的标记方法与标记类型？常用的双链DNA的标记方法是哪两种？ 探针的标记方法：切口平移法、随机引物合成法，末端标记法，PCR标记法，体外转录标记法。 探针按核酸分子分：DNA探针和RNA探针； 按标记物的不同：放射性标记探针和非放射性标记探针。 标记类型：按核酸分子的不同：可分为DNA探针和RNA探针 根据标记物的不同：可分放射性标记探针和非放射性标记探针； 双链DNA探针标记主要方法：切口平移法、随机引物合成法； Southern杂交一般过程及影响杂交因素。 Southern杂交操作步骤: (1) 用限制性内切酶酶切DNA, 经凝胶电泳分离各酶切片段； (2) 转膜：将DNA片段转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上； (3) 预杂交：封阻滤