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菌种鉴定的分子生物学方法 ——16S rDNA测序鉴定菌种 一． 原理 细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16S rDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。 二． 技术路线 该方法包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。具体技术路线如下： 三． 方法步骤 （一）细菌基因组DNA提取（酶解法） 1. 挑取单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。 2. 取2 mL培养液到2 mLEP管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。 3. 加140 μLTE打散细菌，再加入60 μL 10 mg/ml的溶菌酶。37℃放置10分钟。 4. 加入400 μL Digestion Buffer，混匀。再加入3 μL 蛋白酶K，混匀，55℃温育5分钟。 5. 加入260 μL乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。 6. 加入500 μL 70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。 7. 重复第六步。 8. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5mL的离心管。 9. 加入50μL预热(60℃)的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为基因组DNA。 10. 电泳。取3μL溶液电泳检测质量。 注：如果待测菌为乳酸菌等不产生芽孢的菌类，且菌种非常纯净单一，则可以用直接煮沸法。 （二）PCR扩增 1. 根据16S rDNA序列设计保守的扩增引物。 27 F： 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 1492 R： 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 2. PCR扩增体系： 按下表加入引物、模板、Mix和ddH2O，建立PCR扩增体系（50μL） 物品 ddH2O Mix 引物F 引物R 模板 用量 10 μL 25 μL 2 μL 2 μL 1 μL 3. PCR反应 将EP管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。扩增程序如下为： 过程 温度 时间 循环数 预变性 94℃ 3 min 1 变形 94℃ 30 sec 35 退火 50℃ 45 sec 延伸 72℃ 100 sec 再延伸 72℃ 7 min 1 保存 4℃ ∞ 1 4. PCR产物的电泳检测 拿出EP管，从中取出5 μL反应产物，加入1 μL上样缓冲液。点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中。电泳30 min。在紫外灯下检测扩增结果。 （三）扩增片段的回收 根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物。否则从琼脂糖凝胶中切 割核酸条带，并回收目的片段。 1. 称量一2mL的EP管质量，记录。 2. 在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入2 mL的P管内，称量。计算凝胶质量。 3．每100 mg凝胶加入100 μL Binding Buffer，混匀。60℃温育至凝胶融化。 4．全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。 5．加入500 μLBinding Buffer，10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。 6．加入70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。 7．再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。 8．加入30μL预热的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为回收的DNA片段