质粒DNA的提取与纯化(精选).docVIP

质粒DNA 的提取与纯化 实验目的： 1掌握碱变性法提取质粒DNA的原理和各种试剂的作用及方法。 2学习并掌握凝胶电泳法进行DNA的分离纯化的实验原理及方法。 3学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 实验原理： 简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。 溶液Ⅰ50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0 葡萄糖增稠，使悬浮后 的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA抑制DNase的活性。 溶液Ⅱ 0.2M NaOH / 1% SDS ）：使细胞破裂，使质粒DNA与染色体DNA同时变性。 溶液Ⅲ3M 醋酸钾 / 2M 醋酸这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。 μlRNase(50μg/μl),37℃, 2、纯化及电泳 两份完全一样的500μl粗提物→加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）→12000rpm,5min→转上清至新管（V1）→加等体积（V1）酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）→12000rpm,5min→转上清至新管（V2）→加等体积（V2）酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）→12000rpm,5min→转上清至新管（V3）→加1/10V33MNaAc+2V冰乙醇→取沉淀→-20℃,30-60min→12000rpm,15min→弃上清→500μl70%乙醇→12000rpm,5min→弃上清→500μl70%乙醇→12000rpm,5min→吸净上清→37℃,5-10min→两管25μlTE溶液→50μl/组→得纯化质粒DNA。 40ml×TAE→300ml锥形瓶→称0.4g琼脂糖→微波炉沸腾3次→50-60℃→倒板成型 取3μlDNA+1-2μl 6×loading Buffer→混匀→点样→100V，电泳，40min→EB染色10min→水洗10min→紫外成像→分析 注意事项： 1， 提取过程应尽量保持低温。 DNA片段会慢慢断裂。 4，加上溶液2之后混匀动作要轻柔,既保证细菌沉淀在试剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基因组DNA。 5，沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积)，且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。Ⅰ后，将离心管盖好后放于旋涡振荡器上振荡，无白色菌体块状物悬浮在液体中，即已振荡均匀。 3，加入溶液Ⅱ时，要逐滴缓慢加入，边加边轻轻摇动离心管，可观察到离心管中液体呈粘稠的蛋清状无白色菌体块存在。溶液Ⅱ为强碱性溶液，可以使细胞破裂，质粒DNA 和染色体DNA变性。 4，加入溶液Ⅲ并离心后出现白色絮状沉淀。因为溶液Ⅲ为高盐溶液，调节碱性溶液至中性，使变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成白色絮状沉淀。 5，用饱和酚氯仿抽提是试管底出现大量白色沉淀。 6，加入无水乙醇离心后离心管底出现少量的沉淀。加入ET溶液后管底沉淀物溶解。 我们组的电泳条带 图1 质粒DNA 电泳条带 1，从胶的左边开始，各条带分别是：（1）DNA marker，DL-5000（2—13）各组提取的质粒 DNA条带，（14）PUC19 ，(15)λ DNA 2，箭头所标记的是我们组的电泳条带。从上到下依次是：蛋白质，染色体DNA杂带，开环质粒DNA带，线形质粒DNA带，超螺旋质粒DNA带（主带），RNA带。 3，用我们组实验所得的电泳条带与第14条带，即标准的PUC19带型和DNA marker比较可以看出，我们提取到超螺旋质粒DNA条带清晰含量较多。开环质粒DNA和线性质粒DNA的电泳条带不清晰，因此样品中含有少量染色体DNA及线形和环状DNA. 蛋白质带较浅,说明大部分蛋白质杂质已被抽提掉。RNA条带较浅，说明RNA 含量并不多，大部分RNA被RNase降解除去。 我们组本次实验中所提取的质