质粒DNA的提取定量酶切和PCR鉴定(精品).docVIP

生物化学实验报告 姓 名： 宋黎明 学 号： 3130010006 专业年级： 2013级临床医学二 组 别： 第一实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 (Title of Experimetn) 质粒DNA的提取、定量、酶切和PCR鉴定 实验日期 (Date of Experiment) 2014-11-13 实验地点(Lab No.) 第一实验室 合作者(Partner) 王晨星 指导老师(Instructor) 刘安玲 总分 (Total Score) 86 教师签名(Signature) 刘安玲 批改日期 (Date) 2015-1-7 一、实验目的 1、掌握PCR基因扩增的原理和操作方法 2、掌握碱裂解法提取质粒的方法 3、了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法 4、学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作 二、实验原理 1、高纯质粒小量制备（试剂盒法，离心柱型） 碱裂解法：①基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异； ②高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性； ③当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉淀去除； 用改进碱裂解法提取质粒，吸附柱内的吸附膜在高盐、低PH状态下选择性结合溶液中的质粒DNA。蛋白液和漂洗液可以将其他杂质去除。低盐和高PH的缓冲液将纯净的质粒DNA从吸附膜上洗脱。 2、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR） PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在耐高温DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。 变性：加热使模板DNA在高温下90℃-95变性，双链解链。 退火：降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5左右的模板DNA互补退火形成部分双链。 延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 不断重复上述过程以实现DNA的体外大量扩增。 3、质粒DNA的定量（紫外分光光度法） DNA碱基上存在共轭体系，对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰且吸收的强度和DNA的浓度呈正比。当A260=1时，双链DNA溶液的浓度为50(g /ml.蛋白质由于色氨酸和酪氨酸的存在，其最大吸收波长是280nm，可以通过测定样品在260nm和280nm的吸光度比值（A260/A280），估计DNA的纯度。此外紫外分光光度法只能测量浓度＞0.25(g /ml的DNA溶液。 4、质粒DNA的酶切鉴定 ①限制性核酸内切酶是一种识别双链DNA分子的特别序列并在一定部位切断磷酸二酯键水解DNA的酶类。实验使用的EcoRⅠ核酸内切酶和HindⅢ核酸内切酶分别特异性识别5’-G↓AA∣TTC-3’和A↓AG∣CTT序列并在箭头所示的位置打开磷酸二酯键。 不同的质粒DNA含有不同的碱基序列因而含有的酶切位点的种类和数目也不相同，即有不同的酶切图谱。通过选择合适的限制性核酸内切酶把质粒DNA切割成不同大小的DNA片段，在电泳中，根据区带数以及片段迁移的位置，以已知分子量的线性DNA片段为参照，可以判断酶切片段的大小，从而对提取的质粒进行鉴定。 ②琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 ; DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动;DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。 不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系). 三、实验材料 1、高纯质粒小量制备（试剂盒法、吸附柱型） ①仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅 ②材料：含pMD18-T质粒的大肠杆菌DH5αa ③试剂： LB培养基（液体、固体） 、AXYGEN试剂盒质粒提取试剂盒（爱思进，中国）内含：溶液 P1（S1)、溶液 P2 (S2)、溶液 P3（S3）、去蛋白液 PE（W1）、漂洗液 WB(W2）、洗脱液 EB（Eluent)。 2、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR） ①仪器：PCR仪(BioRad MJ mini) 、小型台式离心机（Sigma 1-14）、微量加样枪 灭菌的薄壁离心管 ②材料：大肠杆菌DH5a菌株(含靶基因CHD5片段的pMD18-T)、引物：