5酶蛋白质工程.pptVIP

* * 第五章 酶的蛋白质工程 一、概念： 蛋白质工程是以创造性能更适用的蛋白质分子为目的，以结构生物学与生物信息学为基础，以基因重组技术为主要手段，对天然蛋白质分子的设计和改造。 二、蛋白质的功能基础 蛋白质的功能在很大程度上取决于其空间结构。 蛋白质结构测定 一级结构测定： 直接法：直接测定多肽链的氨基酸顺序。 间接法：从编码蛋白质的基因的核苷酸顺序来推导蛋白质的氨基酸顺序。 三级结构测定： X-射线晶体衍射—研究处在晶体状态下的蛋白质的空间结构 核磁共振(NMR)光谱—研究处在溶液状态的蛋白质的结构。 X-射线衍射技术： 用于蛋白质及核酸三维结构的确定，至今已有数百种蛋白质的结构被确定。 三、蛋白质工程的主要手段 以重组DNA技术为核心的基因工程技术改造蛋白质。 位点特异性突变—基于结构生物学、信息生物学 基因突变 随机突变—基于高通量筛选法 基因内部的剪接 基因剪接 5‘或 3’端的剪接 四、蛋白质工程改造的实际应用 1.枯草杆菌蛋白酶 1）增强抗氧化性 2）改变底物特异性 2.溶菌酶 1)抗菌范围的扩大 2)热稳定性的提高 五、酶的稳定性 1.酶稳定的分子原因 1）共价键： 肽键（peptide bond） —稳定蛋白质和酶主链的核心力量。 二硫键（disulfide bond） —由两个Cys的侧链-SH氧化而成，是某些蛋白质维持结构稳定性的主要因素。 2）非共价键： 疏水相互作用（hydrophobic interaction）: 是维持蛋白质分子稳定的主要的作用力。 氢键（hydrogen bond）： 是稳定蛋白质分子的空间结构，特别是二级结构的重要力量。 静电相互作用（electrostatic interaction）： 又称离子键、盐键、盐桥，是正负电荷间的作用力。对酶分子稳定性有关的盐键大部分形成于分子表面上。 范德华力： 在电中性分子之间的非共价结合。分子间形成的范德华力越大越稳定。 金属离子： Ca2+、Mg2+和Zn2+等高价阳离子与多肽链不稳定的弯曲部分结合，可显著增加酶分子的稳定性。 剂型 蛋白质水平 核酸水平 适合的酶类还不普遍 适用于特殊反应体系和酶类 反应介质 工作量大 简单、经济 稳定剂 微环境改良 成本高 稳定性好，载量高，催化效率高 交联酶晶体 载量较低，易失活 适应所有酶，稳定性高，可重复利用和连续生产 固定化 修饰过程破坏酶分子 适应所有酶，操作简单经济 化学修饰 操作复杂，周期长 从根本上提高酶分子稳定性 蛋白质工程 酶分子改造 不足 优点 方法 途径 2. 稳定酶的方法 思考题： 什么是酶的蛋白质工程 一级结构：构成蛋白质的单元氨基酸通过肽键连接形成的线性序列，为多肽链。 　　一级结构稍有变化，就会影响蛋白质的功能。 　　二级结构：一级结构中部分肽链的弯曲或折叠产生二级结构。多肽链的某些部分氨基酸残基周期性的空间排列。现已报道的蛋白质中二级结构共有四种: α-螺旋，β-折叠，β-转角，无规卷曲。 　　α-螺旋:它是蛋白质当中最为常见的二级结构(图 1.2 (左))。它的每个螺旋周期有3.6个氨基酸残基，其残基侧链伸向外侧，同一肽链上的每个残基的酰胺氢原子和位于它后面的第4个残基上的羰基氧原子之间形成氢键，并且与螺旋轴保持大致上的平行。此外，肽键上的酰胺氢和羰基氧既能形成内部氢键，也能与水分子形成外部氢键。α-螺旋的稳定性很好，除甘氨酸及脯氨酸外的其他各种氨基酸通过肽键构成主链时都有形成α-螺旋的倾向。 　　β-折叠：它也是常见的蛋白质二级结构之一。与α-螺旋不同，它呈片状(,肽链几乎完全伸展的，而非紧密卷曲。此外，β-折叠中相邻两个氨基酸的轴向距离为3.5A;，而不是α-螺旋中的1.5A。β-折叠片中，相邻的两个多肽片段可能是彼此平行的，也可能是反平行的。在蛋白分子内部更多出现的是平行的β-折叠片；而反平行的β-折叠片一段暴露于溶剂中，一段埋于蛋白内部，其氨基酸序列常为亲水和疏水的氨基酸交替排列。 　　β-转角：它大多分布在球状蛋白质分子表面，以改变肽链。它是一个发夹式转折，其特点是在于多肽链中第n个残基的一CO基与第n+3个残基的-NH基形成氢键。因此，一个多肽链的走向可以得到很好的扭转。因此，β-转角在球状蛋白质中是重要的二级结构，起到连接其他二级结构的作用。 　　无规卷曲：它是指没有确