生化实验理论.docVIP

实验1蛋白质的沉淀反应 蛋白质的水溶液是稳定性的胶体溶液 稳定的原因有两个 1 水膜 2 电荷 蛋白质沉淀 物理化学因素影响下，蛋白质稳定性遭到破坏，以固体的形式从溶液中析出的作用。包括可逆沉淀和不可逆沉淀 可逆沉淀: 盐溶（salting in） 纯水或低盐溶液中溶解度较低的蛋白质，通过增加无机盐使溶解度增加 盐析（salting out） 高浓度的中性盐类可以脱去蛋白质分子表面的水膜，并中和蛋白质分子的电荷，从而使蛋白质从溶液中沉淀下来的过程 常用的中性盐：硫酸铵，氯化钠，硫酸钠等 不可逆沉淀 有机溶剂沉淀：如乙醇、丙酮、 生物碱试剂沉淀 :如苦味酸、三氯醋酸（TCA 、钨酸等.在pH值小于蛋白质pI时，其酸根负离子能与蛋白质分子上的正离子相结合 重金属盐沉淀：金属正离子与蛋白质分子中负电荷结合 加热或改变pH等 实验2 蛋白质的透析脱盐 透析法（dialysis） 蛋白质是生物大分子，分子的直径在1-100nm之间，不能通过半透膜（有微孔的膜）；而无机盐等小分子化合物能自由通过半透膜。利用这一特性，将蛋白质与小分子化合物分离开来。这就是透析 本实验利用透析的方法把实验一盐析中所用硫酸铵去掉，达到分离纯化的目的 实验所用半透膜：玻璃纸 实验3 蛋白质的两性实验——酪蛋白的pI测定 蛋白质与氨基酸类似，是两性电解质 蛋白质分子在等电点时不带电荷，溶解度最低，容易聚集沉淀 本实验利用溴甲酚绿做指示剂，根据颜色的变化和等电沉淀的原理，确定待测蛋白酪蛋白的pI 注意事项：用干滤纸 硫酸铵缓慢加入 玻璃纸用橡皮筋扎紧 实验二 蛋白质的定量测定-----双缩脲法测定蛋白质浓度 实验目的：学习双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法 掌握分光光度仪的使用方法 掌握Excel软件制作标准曲线 蛋白质含量：蛋白质混合物中蛋白质的含量或总蛋白质含量 目前常用的方法 1）凯氏定氮法 ①紫外吸收法 2）分光光度法 ②染料结合法 ③比色法： 双缩脲法 Folin-酚法 根据测定时所用的光源波长的不同，分光光度法可分为可见分光光度法、紫外分光光度法和红外分光光度法等几种。 （1）利用吸收光谱对物质进行定性分析 常用的方法有：比较吸收光谱曲线法、比较最大吸收波长法、比较吸光 度的比值。 （2）利用吸收光谱对物质进行定量分析 Beer-Lambert定律－吸收光谱法基本定律 描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系 含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓度和液层厚度成正比。 T I/I0 A Ig1/T IgI0/I KCL 其中：T为透光率； A为吸光率； I0为入射光强度；I为透射光强度； K为吸收系数；C为溶液浓度； L为溶液光程的厚度 以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条通过原点的直线，叫做标准曲线（或称A-C曲线）。 比较法 对个别样品进行测定，且A-C曲线线性良好直接比较测定结果。A标 K标C标L标A未知 K测 C测 L测 C测 A测/A标xC标 2. 双缩脲法测定蛋白质浓度的基本原理 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。 蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应，生成紫红色化合物，称为双缩脲反应。 在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。因此可用比色法测定蛋白质浓度。 注意事项： 须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。 样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。 实验三 唾液淀粉酶活性的观察 实验目的： 掌握酶的催化活性，酶的高效性和特异性 了解各种因素（如温度、pH及一些化学物质）对酶活性的影响 唾液淀粉酶的制备和活性观察 原理：酶是生物体内具有催化功能的生物大分子，也叫生物催化剂。 酶活性: 酶的催化能力,用催化化学反应的速度表示 酶活性的测定方法： 1）定底物 2）定时间 影响酶活性的因素： pH值的影响: 能使酶活性达到最高时的pH值，称为该酶的最适pH。 温度的影响: 在一定温度范围内，随着温度的升高，酶促反应速度增加，直至达到最大值。在一定条件下，能使酶活性达到最高的温度即酶的最适温度。 激活剂和抑制剂的影响: 能增高酶活性的物质即称为酶的激活剂，能降低酶活性却又不使酶变性的物质叫酶的抑制剂。 注意事项：酶同时放，唾液、淀粉摇匀 实验四 电泳技术概论 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳 目的：了解电泳的概念和一般原理； 掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作技术； 判别动物血清中各种蛋白组分 原理：不同溶质由于所带电荷性质，数量以及分子大小、形状不同，在电场中的泳动方向和速度不同而被分离. 迁移率与带电分子所带净电荷成正