分选型流式细胞仪精读.pptVIP

当细胞或者其他微粒通过聚焦的激光束时，它们发出散射光并发射荧光。由于每个激光束都聚焦在很小的点上，并且微粒通过流动池速度很快，因此散射光或者荧光发射的时间很短-往往只有几微秒。PMT将这些光信号转换为电子信号，称为脉冲。 参数是脉冲的特性之一，它是由单一的光电倍增管或者光电二极管产生，用于测定荧光或者散射光。可以测定脉冲的三个特性：面积，高度或者宽度。 当微粒通过激光束时，脉冲开始。此时，激光强度和信号强度都很低。 当微粒达到激光束中间时，脉冲达到最大强度或者高度，此时激光束和信号强度都最高。此时测定峰值强度或者脉冲高度。 当微粒离开激光束时，脉冲减弱。 * FCS 2.0格式 常以列表模式（LIST MODE)：将每个细胞的每个检测参量依次排列顺序存储 * 液流振荡形成液滴（每个液滴内含有一个细胞）、在断裂成液滴前加上电荷（两种或四种电荷）、在高压偏转板形成的电场下发生不同角度的偏转、落入相应的分选收集装置中。 * 八角和三角检测器是BD专利的探测器阵列，利用一系列光的反射将光信号引导到目标探测器中，得到高效的光信号收集和最大的光信号保留。BD这种序列反射的设计提高了仪器的灵敏度，首先收集最暗的发射光信号，从最长的波长（通常为PE-Cy?7）开始收集，依次到最短的波长（FITC）。 * 在BD FACSAria流式细胞仪上，细胞受激光激发时，通过激光照射区的流速更慢，激光照射时间更长，液流只是从喷嘴进入空气时才被加速，然后振荡断裂为液滴，细胞被分选收集。使用这种新型石英杯流动检测池，可以在低功率激光器的条件下，获得非常高的检测灵敏度。因此，仪器可以使用空气制冷的固态激光光源，就不再使用与高功率激光器配套的特殊电源和冷却设备了。因此，采用石英杯流动检测池的有两个突出的优点：一是提高了激光的激发效率，二是增强了发射光信号的收集效率。 * * 传统的液滴延迟时间确定方法－从1974年使用至今 传统方法: 在每天的实验开始之前，需要用微球先进行预分选在载波片上，并不断调整液滴延迟的参数后反复试验，最后确定合理的液滴延迟时间。 一旦液滴延迟时间确定后，该时间固定，不能根据细胞粘连等情况自动调节。 操作要求很高，需要很长时间的手工摸索，而且需要配备显微镜。 准备一管含有单一荧光微球的样本管 设定分选所有的荧光微球到左边的收集管 开始分选，放下滤光片，保证只有荧光微球才能被看到； 调节drop delay，使得所有的光斑全部出现在左边 左侧是实时分选的点，通过不同的daler时间来看分选的效率，最终确定一个最合适的时间。 Accudrop微球是一种荧光微球，被位于偏转板下方的红激光激发后，发射光可以透过侧液流监视器前方的滤光片，用于测量drop delay。 * 当液流从喷嘴中喷出后，在电磁传感器产生的高频振荡下，形成稳定的液滴，即液流的断点始终维持在一个固定的位置，所以检测点和液流断点之间的距离维持不变 在分选过程中，每一个液滴都被分成32等分进行分析，液滴分辨率的提高使得仪器对每个细胞颗粒在液滴中的位置的分析更加精确，从而得到更好的分选纯度和产率。 * 纯度模式中的分选收集高纯度的分选样本，这一模式牺牲了回收率和产率。 4路分选纯度模式建议用于需要精确偏转的4路分选中。 在回收模式中，只有Yield Mask设定为最大值。以牺牲纯度来优化回收率和产量。 单一细胞模式建议用于微孔板设定或者需要精确计数的情况。 * * 装机时报告仪器性能基线 自动调整电压、激光参数，保证不同时间检测数据的一致性 提高仪器设置的精确性，降低不一致设置造成的检测误差 仪器追踪性能（20点质控图），帮助用户了解仪器性能，以及在使用过程中的仪器变化 简化实验设置，根据每日仪器状态自动调整实验的电压设置，保证不同时间实验数据的一致性 减少停机检修时间 20个点进行追踪 * 一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高自发荧光越强 特异荧光，即抗体F(ab’)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光 非特异荧光，即抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光 * 石英杯激发保证了用小功率激光的效率远远大于大功率空气激发的效率，光毒性小，很好的保证细胞活性。 稳定而零剪切力液流系统设计最大程度的保证了细胞的活性，同时专利的喷嘴设计，进一步保证了细胞活性。 既有样本温控系统也有收集仓温控 Aria Ⅱ自动无菌消毒清洗 软件向导清洗自动执行 无菌分选结果保证，文献支持 全自动标准化的无菌清洗流程，密闭式的上样和分选收集仓，执行一次可以保证整个管路系统在以后连续4天内菌量为0的最佳效果。 采用一管CST微球，方便检测 微球染