分子生物学5精读.ppt

多克隆位点 Ampicillin, kanamycin, Hygromycin B 抗性基因 用于 E.coli 中复制的复制起点 来源于SV40 的复制起点 Neomycin, zeocin, blasticidin 抗性基因，用于筛选稳定表达细胞系 CMV (cytomegalovirus), SV40 (Simian virus 40), RSV, 人EF1? 启动子等 转录终止子 加 PolyA 的信号序列 3. 哺乳类细胞表达载体 目的蛋白与 GFP (绿色荧光蛋白) 的 N 端形成融合蛋白。 Actin-GFP 融合蛋白在 HeLa 细胞中的暂态表达。 来自脑心肌炎病毒 (encephalomyocarditis virus) 的 IRES (Internal ribozyme entry site, 内部核糖体进入位点) 使双顺反子 RNA 同时翻译出两种蛋白质 (目的蛋白和GFP)。 用于基因治疗的病毒表达载体 逆转录病毒载体 (Retroviral vectors) 慢病毒载体 (Lentivirus vectors) 腺病毒载体 (Adenoviral vectors) 用于转基因动物的表达载体 含组织表达特异性的启动子 用于噬菌体展示 (Phage Display) 的载体 将目的基因插入噬菌体外壳蛋白基因，形成的融合蛋白出现在噬菌体表面，目的蛋白或多肽保持相对独立的空间结构和生物学活性。 5. 其他特殊表达载体 逆转录病毒载体 转化 (Transformation) 将载体或重组载体导入细菌的过程。 转染 (Transfection) 将载体或重组载体导入真核细胞的过程。 转导 (Transduction) 利用噬菌体将载体或重组载体导入细菌的过程。 感染 (Infection) 利用病毒将载体或重组载体导入真核细胞的过程。 (三) 载体导入宿主细胞的方法 感受态细胞 (Competent cells) 是有利于外源 DNA 分子进入的细胞。转化方法不同，制备感受态细胞的方法也不同。 化学转化法 用 CaCl2 处理大肠杆菌，CaCl2 促进 DNA 结合到细菌表面并增加细胞对 DNA 的通透性。 电穿孔法 (Electroporation) 当细胞经受高压电流脉冲时，细胞膜上可逆地形成小至 2 nm大小的孔洞，使 DNA 分子通过孔洞进入细胞质。 1. 转化方法 Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ 化学转化 基因组 DNA 质粒 DNA 热休克 (42?C) 电转仪 (Electroporator) 电转杯 电穿孔法 (电转化) 电转仪 电转杯 1 mm 间隙 ：用于细菌的转化 2 mm 间隙 ：用于细菌的转化、 真菌的转化 (染) 4 mm 间隙：用于哺乳类细胞、 人类细胞的转染 CaPO4-DNA 共沉淀法 钙离子与 DNA 的磷酸基团结合形成不溶性沉淀 CaPO4-DNA，并附着于细胞表面，通过细胞内吞作用被细胞所吸收。 DEAE-葡聚糖方法 带正电荷的 DEAE-葡聚糖与带负电荷的 DNA 磷酸基团结合形成 DEAE-葡聚糖-DNA 复合物并结合带负电荷的细胞膜，通过细胞内吞作用被细胞所吸收。 2. 转染方法 脂质体法 阳离子脂质富集 DNA 分子，形成稳定的 DNA-脂质体并附着于带负电荷的细胞膜，脂质体与细胞膜发生融合，DNA 被细胞所吸收。 人工合成的阳离子脂质 Transfectam 的结构 电穿孔法 原理同电穿孔转化方法，但所用的参数不同。 显微注射法 (microinjection) 利用管尖极细 (0.1 - 0.5 ?m) 的玻璃微量注射针，将外源基因直接注射到受精卵的原核 (pronuleus) 或培养细胞中。 构建携带目的基因的表达载体 表达载体被细胞吸收到细胞质中 表达载体转移到细胞核中 目的基因及选择性标记整合到 基因组 DNA 中 (四) 目的基因在真核细胞中的表达 暂态表达 稳定表达 转染 暂态表达 (Transient expression) 表达载体转染动物细胞后，表达载体以附加体 (episome) 形式存在于细胞核中。 表达载体上的目的基因在 24 - 72 小时内表达，并随着附加体的消失而最终消失。 稳定表达 (Stabl