表面与界面课题组实验方法整理.docxVIP

细胞实验相关1.1细胞培养、增殖或毒性检测1.1.1 细胞培养：将冻存细胞从液氮中取出，37 °C 水浴解冻。将解冻细胞悬浮液从冻存管中转移到离心管中，1000 r/min离心5 min.离心之后去除上层清液，加入新鲜培养基，充分吹打之后再次离心处理一次离心之后去除上层清液，加入新鲜培养基，充分吹打将吹打均匀的细胞悬浮液转移到细胞培养皿中，并加入适量新鲜培养基，放到细胞培养箱中培养细胞培养3、4天左右培养皿中细胞覆盖率80 %左右分盘继续培养，最后根据实验样品数目计算所用细胞数合理进行分盘满足实验所用细胞增殖：样品消毒处理：根据样品不同，可以选择高压蒸汽灭菌、酒精消毒、紫外照射消毒。培养有细胞的培养皿从培养箱中取出，移去培养基， PBS冲洗两遍，加入适量胰酶（预先预热，小盘0.5 ml，大盘1 ml），放在培养箱中2~3 min，在显微镜下观察细胞解粘附即可（细胞形貌成球形），加入新鲜培养基，充分吹打培养皿底部，将细胞悬浮液转移到新离心管中，离心1000 r/min离心5 min。离心后，将离心管中上清液去掉，加入适量新鲜培养基，充分吹打，形成细胞分布均匀的悬浮液，取10 μl，用细胞计数器在显微镜下进行细胞计数，得到细胞悬浮液中细胞浓度根据样品数量计算所用细胞总数（单个样品细胞接种密度为5 × 104）以及所用含细胞的悬浮液体积（单个样品所用含细胞的悬浮液200 μl），根据前一步所得细胞浓度，取一定体积悬浮液，加入新培养基，配制满足实验需要的含细胞的新悬浮液，充分吹打，制得用于接种的细胞悬浮液。消毒后的样品转移到细胞培养板中，PBS清洗两遍（每次10 min），每个样品预先加入800 μl培养基，然后加入200 μl含有细胞的悬浮液，轻轻摇晃混合均匀，放入细胞培养箱中培养1、4、7天。细胞培养到预定时间，进行定量分析的样品，取出原培养基，PBS清洗两遍，将样品转移到新的培养板中，加入0.5 ml含有10 % AlarmaBlue的新鲜培养基，继续培养4 h。4 h之后，摇晃均匀后，取出100 μl培养基转移到96孔板中，在波长570 nm和600 nm下测量吸收值，根据公式计算得到细胞的增殖率。细胞培养到预定时间，进行表面形貌观察的样品，取出原培养基，PBS清洗两遍，将样品转移到新的培养板中，加入2.5 %戊二醛溶液，4 °C避光过夜保存进行细胞固定。之后样品依次用30 %，50 %，75 %，90 %，95 %，100 %的乙醇/水溶液进行脱水，之后用六亚甲基硅烷/乙醇溶液（1:2，2;1和纯六亚甲基硅烷）进行干燥，在通风橱中充分干燥后，表面喷金用扫描电镜观察细胞形貌。1.1.3 细胞毒性：用样品直接测试毒性和细胞增殖实验步骤一样，如果用浸提液做步骤稍作改变即可，如下：样品浸提液制备，将消毒样品在培养基中浸泡24 h，所得浸提液为100 %浸提液，可以根据需要和设计稀释为不同浓度的浸提液将细胞提前接种于96孔板中，培养一天，之后将原培养基移除，加入浸提液共同培养，继续培养预定时间（比如1 d或3 d）与测定细胞增殖方法一样，测量与细胞浸提液共同培养后细胞增殖速率，与阴性对照和阳性对照组比较，计算得到细胞活性，从而判断浸提液对细胞生长是否显示毒性1.2干细胞骨架染色1.2.1 经验分享因PEEK分子中苯环结构会在汞灯光源下被激发出荧光，致使背底荧光较深，无法识别细胞，因此有关荧光染色的实验均不适用于PEEK材料。1.2.2所需用具及药品PBS（细胞房内/外用），4%PFA，0.1V%Triton X-100，1wt%BSA，FITC，DAPI，指甲油或502，盖玻片（提前准备好用24孔板切割成的独立小孔罩，并超声清洗干净，以保护样品用于观察）。1.2.3实验步骤注意：整个固定、染色及观察过程需在避光环境中进行，以防荧光过早淬灭接种细胞，1 x1样品（每组3~4个，每个时间点各1个），密度5x104 cell/ml；到时间后（一般为1/4/24h或1/3/6/24h，根据具体情况定），将样品换至新的24孔板，以去除24孔板中样品外细胞的影响，用PBS清洗2遍，每遍5min；用4%PFA固定10min，用量为每孔500μL；PBS清洗3遍，每遍5min；用0.1V%Triton X-100通透，每孔500μL，时间2min; (PBS稀释：50mL PBS中加50μL Triton)PBS清洗3遍，每遍5min；加入500μL 1wt%BSA（用PBS稀释），时间20min；PBS清洗1遍，5min；加入100μL（PBS和FITC混合液），染骨架，60min（1h）；(配制比例为1.2ml PBS：20μLFITC)10. PBS清洗3遍，每遍5min；11. DAPI染核5min，每孔加入500μL；(配置比例为DAPI：