2-3章细菌和链霉菌的分子克隆载体课稿.pptVIP

细菌人工染色体（BAC） 基于大肠杆菌F质粒构建的高容量低拷贝质粒载体。 P1 噬菌体载体和 P1 人工染色体载体? P1 噬菌体 ：大肠杆菌的一种溶原性噬菌体。 P1 噬菌体载体 工作原理类似黏粒载体 外源片断70-100kb P1 人工染色体载体（PAC） P1 噬菌体载体的改造，结合了P1 噬菌体载体和 BAC载体的优点。 克隆外源片断130-150kb pYAC载体的结构 9. 酵母杂交系统载体 主要用于研究DNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质之间的相互作用，可用于新基因的克隆。该类载体可分为两类： 一类载体中存在一个DNA-结合序列(BD)，它与已知的钓饵序列融合；另一类载体则含有基因表达激活序列（AD），它则与未知或已知的捕猎序列融合。 单杂交系统载体 双杂交系统载体 三杂交系统载体 除上述普通型的各类载体外，还有其它不同功能的载体： 表达型—yeast expression plasmid; 启动子探针型—yeast promoter plasmid, YPp; 杂合型—yeast hybrid plasmid, YHp,与阅读框架探针型相同。 双杂交系统和载体 二、丝状真菌克隆载体 1.丝状真菌的特点 1）?属低等真核生物，结构简单，易于培养 2）?基因结构与高等真核生物的基因结构具较大相似性，如内含子数目、位置等 3）?用于生产某些具生物活性的基因产物更具吸引力，如糖基化、蛋白质外泌 4）?有些丝状真菌的的遗传背景较为清楚 2. 丝状真菌克隆载体 1） 自主复制载体，其复制起点来源于以下三类DNA： i. 线粒体质粒，如来自间型脉孢菌(N.intermedia)线粒体质粒: pBR322+线粒体质粒+qa-2+ pALS1 转化粗糙脉孢菌 pALS2（高频转化小质粒） ii. 类质粒（plasmid-like)，如由柄孢壳菌(Fedospora auseniw)的类质粒(2539bp)所构建的克隆载体可达1000-9000/μg的转化率，可重新分离，无重组发生，其复制起点序列与酵母和海拉细胞线粒体质粒复制子序列相同。 iii. 染色体复制子 ⅰ)构巢曲霉（A.nidulans)复制子 pILJ16(5.4kb)+AMA1(6.1kb) ARp1(4.5kb) 转化频率20,000/106原生质体·250ngDNA，可在黑曲霉(A.niger)和米曲霉(A.oryzae)以相同转化频率转化。10-30 copies/单倍体基因组 ⅱ)玉米黑粉菌(Ustilago maydis)复制子 9×104 /ng DNA，25 copies/cell 2）整合型载体 由E.coli克隆载体加上一适合于丝状真菌的标记基因构成，转化频率1-10/μg DNA 3）标记基因 amds—乙酰胺酶，dir—线粒体ATP合成酶，qa-2-分解奎尼酸脱氢酶，acuD—异柠檬酸裂解酶，Hgyr—潮霉素抗性。 克隆外源DNA片断：100-300kb 工作原理类似常规质粒克隆载体 比较稳定。每细胞只有一个拷贝，不会重组。 BAC: 是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状 DNA 分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制子 oriS （ Shizuya et al. 1992 ），一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶（ （RepE） 以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座 （ parA , parB , 和 parC ） 。 * * 第四节 细菌和链霉菌的分子克隆载体 一、革兰氏阴性菌克隆载体 1. 移动载体（mobilizable vector） 1)?特点 i. 广谱宿主范围，即复制子和遗传标记具很宽适应范围 ii. DNA的转移常常需要经过中间宿主细胞和借助于辅助质粒，DNA进入中间宿主细胞可用直接转化 2)?结构