【DNA测序技术】技术方案.pptVIP

# DNA测序技术 DNA测序技术的含义 DNA测序技术，又叫基因测序技术。 即为测定DNA序列的技术。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的主要技术有双脱氧链末端终止法和化学降解法两种方法。目前，Sanger测序法已得到了广泛应用。 DNA测序技术的建立 1963年，Sanger等人第一次完成了胰岛素51个氨基酸的序列测定。 70年代初，sanger建立了第一种直接测定DNA序列的方法——加减法。 70年代后期，Sanger和Maxam等人又分别建立了双脱氧链末端终止法和化学降解法，将该技术推进到“直读”阶段，使核酸序列测定远比蛋白质氨基酸序列测定容易。 加减法 加-减法（plus-minus sequencing）: Sanger于1975年发明，使人们有可能第一次“读”出DNA的碱基序列。 加-减法可分为“加法体系”和“减法体系”。 “加法体系”和“减法体系”的准备工作： 待测DNA的单链作为模板，一个合适的引物，四种dNTP， 用同位素标记； DNA聚合酶从引物开始合成一条互补链； 除去那些未参与合成的dNTP，将剩下的合成产物，分成两 部分； 一部分用于加法系统，一部分用于减法系统。 加法系统：将用于加法系统的产物再分成四小份，每一小份中仅仅将四份中的dNTP的一种加入反应体系。比如仅加入dATP。由于DNA聚合酶具有3′→5′的外切酶活性，而反应体系中缺少另外三种必要的dNTP，合成产物就从3′→5′方向降解。然而由于存在dATP，当遇到dA的位置降解反应就停止了。因而所有的片段都是以A结尾的。同理，可以分别制备以C、G或T结尾的另外三组片段。 【加法系统实际就是以降解为条件，以DNA聚合酶的3′→5′的外切酶活性为基础，当降解过程遇到试剂中所富含的dNTP时，反应就停止】 四组片段在同一块凝胶板的不同样品槽中同时电泳，从放射自显图上就可以推断出碱基序列。从A样品槽查出的放射性区带代表A在片段中的位置，同理也可确定出C、G和T的位置。 由于技术上的原因，只用一种方法有时不能得到完全正确的结果，因此又设计了一种减法系统。 减法系统：也是将上述酶促产物分成四小份，每一小份中只加入三种dNTP，比如缺少dATP。在这个反应体系中，DNA聚合酶能够把片段继续合成下去，但是在遇到应该是dATP参入的位置时，合成反应就停下来了。这就可以得到一个都是以A前一个位置为结尾的片段组，电泳后同样可以定出A的位置。 【减法系统实际就是以合成为条件，当合成过程缺少需要的dNTP时，反应就停止】 局限性： 由于反应速度上的差异，有些片段可能多些，另一些片段可能少些，有时可能导致漏读和重读，有时图谱上还会出现假谱线，当同样碱基排列时图谱上有时只出现一条带。因此用这个方法测定DNA片段可能有1/50的误差。 目前常用的是它的改进法——双脱氧末端终止法。 双脱氧末端终止法 双脱氧末端终止法以DNA合成反应为基础。 1、dNTP（脱氧核苷三磷酸dATP、dGTP、dCTP、和脱氧核苷三磷酸dTTP）是合称DNA分子的底物。 2、dNTP分子的戊糖五元环3‘位碳原子上的羟基进一步被氢原子所取代，则相应的形成双脱氧核苷三磷酸ddNTP。 一、基本原理 3、ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基末端。 4、由于没有3’羟基，不能通过5’-磷酸基团同后续的dNTP形成3‘，5’磷酸-二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。 5、终止于这一“异常”核苷酸处，ddNTP位于DNA延伸链的最末端。 二、主要步骤 1、单链DNA模板的制备——强碱处理，双链变性解链。 2、DNA模板与测序引物退火——68℃加热2min再缓慢冷却至30℃。 3、掺入法标记反应——底物dNTP，放射性核素标记一种。 4、延伸-终止反应——4等分，加于4反应管（ddNTP：dNTP=1:8）于37℃进行终止反应。 5、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 6、放射自显影——X射线胶片。 7、阅读测序结果。 末端终止法 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 根据寡核苷酸的大小来分离，因此可将全长产物与不完整的短分子分开。电泳时通常每一泳道至少加1mg合成的寡核苷酸，电泳后在紫外灯下定位寡核苷酸条带，将长度正确的寡核苷酸从凝胶上切下。 原理： 蛋白质或多肽与SDS结合，经热变性和二硫键的还原，形成所带负电荷相对一致的非折叠衍生物，其泳动速度主要由分子量决定，片段越短，泳动速度越快。 化学降解法 建立在对原有DNA的化学降解过程基础之上。 1、单侧末端标记的DNA片段在5组相互独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每