4-1化学发光免疫技术课稿.ppt

鲁米诺在化学发光反应过程中发蓝光，最大发光波长为425nm。 * 标记后的抗原或抗体，用于免疫分析 * * ECLI是继EIA、RIA、FIA、时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）之后的新一代标记免疫测定技术； ECLI是电化学发光(ECL)和免疫测定相结合的产物； ECLI是目前最先进的标记免疫测定技术之一。 * 1.一般的化学发光免疫的标记物是标记催化酶（辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶）或化学发光分子（鲁米诺或吖啶酯类），其发光强度受周围影响大，有时会不稳定。 2。检测时，必须分离结合相和游离相，操作步骤较多。 发光特点：采用联吡啶钌为标记物，在三丙胺自由基的催化及三角形脉冲电压激发下，只需0.01S就可发出稳定的光。 * * 1.在工作电极（阳极）上施加一定的电压能量作用，2价的三联吡啶钌释放电子发生氧化反应，生成3价三联吡啶钌，同时电极表面的TPA也释放电子发生氧化反应而成为阳离子自由基TPA+，并迅速自发脱去一个质子，从而形成TPA自由基。 2.具有强氧化性的3价三联吡啶钌和具有强还原性的TPA自由基发生氧化还原反应，结果使3价的三联吡啶钌还原成激发态的2价三联吡啶钌（其能量来源于3价的三联吡啶钌和TPA自由基之间的电位差），激发态的2价三联吡啶钌以荧光机制衰变释放出620nm光子。 3.反应体系中仍存在2价的三联吡啶钌和三丙胺。循环，信号不断放大。 * 采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8 μm的聚苯乙烯微粒。其特点是反应面积比板式扩大20－30倍，吸附效率高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相，反应速度大大加快； * * 结合了活化的三联吡啶钌衍生物素即[Ru(bpy)3]2+ + N羟基琥珀酰胺酯（NHS）的TSH抗体和结合了生物素的TSH抗体与待测血清同时加入一个反应杯中孵育9分钟。三联吡啶钌标记抗体和生物素标记抗体与待测标本 同时加入一个反应杯中孵育反应 * 将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育9分钟，使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、TSH抗体连接为一体，形成双抗体夹心法。 将链霉亲和素（SA）包被磁珠加入反应杯中，再次孵育，使生物素（B）通过与亲和素（A）的结合，将磁珠、Ab连接为一体，形成双Ab夹心法。 链霉亲和素包被、生物素化抗体、以增大抗体结合量，达到放大效果。  * 双抗体夹心法 形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物， * 蠕动泵将形成的 [Ru(bpy)3]2+－抗体－抗原－抗体－磁珠复合体吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的TSH抗体（与生物素结合的和与[Ru(bpy)3]2+结合的抗体）也被吸出测量室。蠕动泵将形成的 [Ru(bpy)3]2+-Ab-Ag-Ab-B-SA-磁珠复合体吸入流动测量室，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的Ab也被吸出测量室。 * 蠕动泵加入TPA，电极加电压，启动ECL反应过程。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，其与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈线性关系,故可测出待测Ag的含量。紧接着，蠕动泵加入含三丙胺（TPA）的缓冲液，同时电极加电压，启动ECL反应过程。 这时将上述复合物吸入流动室，同时引人TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓度成正比。 * 终止电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室，准备下一个样品测定。 甲状腺激素，甲肝，乙肝，已成为一种重要的非同位素标记免疫分析方法，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测。 * 用化学发光剂（吖啶酯或鲁米诺类）直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-化学发光剂标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，化学发光剂在不需要催化剂的情况下分解、发光 。 由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。 3.1 直接化学发光免疫分析 发光 Y Y Y 磁微粒 被测抗原 + 抗体 + 带吖啶酯标记物抗体 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 冲洗后 （1） 加入H2O2 （pH10） （2） 加入碱 （pH10） 直接化学发光的机理（夹心法） 化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme 　immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶