共焦显微术简介.docVIP

共焦显微术 摘要：共焦显微术的概念自20世纪50年代末由美国的Minsky提出以来，由于其具有高分辨率特别是纵向高分辨率，以及数字图像三维层析的特点，逐渐受到越来越多专家的重视，被广泛应用于生物医学、材料科学、微电子制造、精密测量等领域的检测与分析。本文简要介绍共焦显微术的原理，分析影响其性能的几个重要因素，讨论了几种较典型的共焦显微镜的构造和特点。结合我们现有的技术储备，阐述了开发新型共焦显微镜的条件。最后展望共焦显微镜的发展前景。 关键词：共焦，三维光学层析，纵向分辨率，扫描 引言 共焦显微术（Confocal Microscopy）的概念首先由美国的Minsky在20世纪50年代末提出来[1]，随后P.Davidovits, A.f.Slomba[2]和C.J.R.Sheppard[3]等多位学者对共焦成像进行了更细致的研究。越来越多的基于共焦原理的显微术被开发出来。但是由于计算机发展水平的制约，直到70年代才有真正实用的共焦显微镜问世，80年代中期才有商品机型出售[4]。九十年代以来随着计算机图像处理技术的发展，共焦显微术三维层析能力的优点也逐渐凸现出来，受到越来越多研究人员的重视。近几年对共焦显微术的研究已形成了一个世界性的热潮，人们已经研制出了多种多样的共焦显微镜，如点扫描激光共焦显微镜、线扫描激光共焦显微镜、光纤激光共焦显微镜、荧光共焦显微镜、共焦干涉显微镜、全息共焦显微镜、非扫描激光共焦显微镜等等。 共焦显微镜具有高分辨率尤其是纵向高分辨率的特点，使得它可以对样品的轴向进行光学层析，从而可以重构出样品的三维图像。它突破了普通光学显微镜衍射极限的限制，横向分辨率是相同数值孔径的普通光学显微镜的1.4倍[1]。纵向分辨率可以达到亚微米级，因此可以对厚的生物样品进行轴向层析。通过对层析图像的重构，会得到样品的三维立体图像。在探测器和样品前面加的小孔光阑使得只有当样品处于焦平面时的散射光才能被探测器所接收，大大削弱了杂散光的影响[5]，所以系统有很高的信噪比， 图像有很高的对比度和清晰度。共焦显微术的这些优点使得它广泛应用于生物医学[4]、材料科学、微电子制造、精密测量[6]等领域，并且还在不断的完善和发展。 本文论述了共焦显微术的基本原理。对共焦显微镜的小孔光阑大小、高精度扫描系统的设计和光学层析与重构算法等几个关键技术进行探讨。重点介绍了几种国内外最新的共焦显微镜的结构特点及应用价值。共焦显微术是一种现代先进成像技术，伴随着光学、精密机械、计算机等学科的发展，共焦显微术将有广阔的应用前景。 1共焦显微术原理 共焦显微术的基本原理如图1所示。共焦显微镜分为反射式与透射式两种形式[1]。点光源发出的光经物镜后聚焦到物体的表面，再由物体反射或透射后经聚光镜再聚焦到探测器。点光源、物体、探测器前的小孔三者是互相共轭的。由于探测器前面放置了小孔光阑，使得杂散光被大大消除，而且小孔位于聚光镜的焦点处，非物镜焦平面上的光线被挡住，这样探测器的信噪比就大大提高，成像有很高的对比度和清晰度。由扫描机构对物体进行xy平面扫描就能得到物体一个平面的图像，再由轴向扫描就可以得到物体多个层面的扫描图像，这个过程称为光学层析（Optical Sectioning）[7]。各层图像经过计算机图像处理就可以重构出物体的三维图像。其横向和轴向分辨率可分别达到100nm和50nm[8]。 （a）反射式共焦系统 （b）透射式共焦系统 图1 共焦显微术原理 2共焦显微镜的几个关键技术 共焦显微镜是集光、机、电、算为一体的精密显微系统，各子系统性能的好坏直接影响到共焦成像的质量。下面就对共焦显微镜的几个关键技术作简单探讨。 2.1 共焦小孔光阑大小的选择 共焦显微术的核心就是“共焦”。而要实现共焦最关键的就是小孔光阑大小的选择。由于是点共轭成像，小孔光阑尺寸越接近理想点，则分辨率越高，成像质量越好；但小孔如果过小那么通过小孔的成像光能就非常少，探测器无法接收足够的光能成像。理论计算证明[9]，当小孔的直径等于艾利斑大小时既能保证共焦成像的高分辨率和层析能力，又有足够的光能通过小孔被探测器接收。 2.2 高精度扫描系统的设计 要完成对整个物体的三维成像必须要有高精度的扫描系统，除了xy方向的二维扫描外，轴向的扫描精度对共焦显微术来说尤为重要。目前主要采用的 扫描方式主要有以下几种：（1）机械式工作台扫描。物体放在工作台上，由步进电机或压电陶瓷驱动工作台三维移动而光路不动。其优点是工作台设计简单，易于实现高精度，缺点是扫描速度较慢，不适于在线测量。（2）光束扫描。在光路中加入振镜使光束高速偏移，焦点在物体上扫描。其优点是机械震动小，精度较高，但速度还没有达到在线检测的要求。（3）Nipkow盘扫描[10]。通过Nipkow盘的旋转而其他部件不动