玉米核型分析.docVIP

4、实验原理 植物细胞染色体的观察和分析, 对于染色体核型分析以及培养过程中细胞变异等遗传学现象的研究具有重要意义。风油精法和去壁低渗法是常用的2 种方法,。植物细胞去壁低渗火焰干燥法制片，不需要特殊的仪器设备，容易获得形态完整，比较分散的中前期染色体对染色体小而且多的植物进行染色体记数和组型分析更显示出其优越性。本试验中所使用的风油精法制片，不但方法简便，而且也能和去壁低渗火焰干燥法制片取得同样的效果。经风油精法制备的染色体标本，细胞的染色体形态清晰，分散性好，染色体周围无细胞质残留，特别是细胞的染色体数目完整，不会因制片的机械力造成染色体丢失，同一细胞的染色体分布在一个小范围里。 5、 染色体制片 本实验采用两种染色体制片方法，即去壁低渗火焰干燥法制片和风油精法制片。 5.1去壁低渗火焰干燥法[1,2] 1 催芽: 种子在75% 酒精中浸泡消毒然后清水冲洗, 浸泡10 h 以上使其吸水膨胀 中间 换水1~ 2次 。在培养皿中垫2~ 3层滤纸, 加水湿润, 然后将种子均匀地摆放在滤纸上, 种子间距约015 cm, 盖上盖, 25~ 28 ℃ 条件下培养。 2 取材预处理:待根尖长到1 ~ 2 cm切取根尖015 cm, 投入青霉素瓶中 一个青霉素瓶投入100个左右 , 加入一定量 淹过根尖即可 的0.1002M 8 - 羟基喹啉和与秋水仙素 1: 1 的混合液预处理在18℃，玉米根尖处理2 h。 3 固定: 将预处理过根尖用蒸馏水冲洗两次, 移入体积10倍于材料的卡诺氏固定液 乙醇: 冰醋酸 3:1 中, 固定24 h然后用95% 酒精冲洗, 再转入70% 酒精中, 于4℃ 冰箱内保存, 不超过2个月. 4 前低渗: 将固定后的根尖转入0.1075 mo l / L KC l中, 4 ℃ 前低渗4 h, 使细胞充分吸水, 细胞器崩解, 细胞质分散或部分溶解, 细胞壁易于解离消化, 染色体分散。 5 解离: 酸解法, 材料加解离液 1NHCl 的量约为材料的3~ 4倍, 60 e 解离5 min。 解离完毕, 用自来水洗3次, 每次5 min, 将解离液洗净。解离时间不足, 细胞壁没有完全消化, 染色体便无法分散、铺展; 解离时间过长, 则可能导致细胞离散丢失。 6 后低渗: 在4 ℃下低渗3 h, 后低渗处理使细胞吸水膨大, 染色体易于分散, 但此时果胶层和细胞壁已崩解, 细胞膜失去外部约束力, 极易吸水膨胀而破裂, 因此后低渗的时间一定要严格控制, 否则根尖材料就会变成细胞的残渣了。 7 再固定: 吸去蒸馏水, 注入固定液再固定10~ 15 in。 8 滴片: 取一张预冷载玻片, 用镊子夹取1~ 2个根尖置于其上, 加一滴固定液, 迅速用镊子将根尖夹碎, 夹去大块组织, 趁材料未干时再加一滴固定液, 将玻片倾斜, 使材料均匀涂布在载玻片上, 然后在酒精灯火焰上微烤, 将其烘干 温度过高会使细胞变形 。载片干燥后, 用记号笔在涂布细胞的一面的边角上做好记号。 9 染色: 用磷酸缓冲液 pH 6.18 与Giemsa原液按20 : 1混合配制Giemsa染液。在染色缸中倒满染色液, 顺着缸壁上的槽把玻片插入染液中, 染色2 h。 10 选那些细胞分散、染色体相互不连、不弯曲而又清晰的制片进行显微摄影、胶卷冲洗、照片放大。每种材料观察选出约 10 个细胞进行核型分析。 3.2.2 风油精法制片[3,4,5] 1 材料培养：将种子放在少许清洁水中，用纱布覆盖置入人工气候箱内催芽20-40h。 2 前处理：煎取根尖（生长点部分）置于 1.25μl/ml 风油精溶液中（10μl 风油精 溶于 8ml 对二氯苯溶液），在 20℃-25℃材料培养 1.5-2h。 3 固定：经过上述过程处理的材料用蒸馏水冲洗几次，然后转入甲醇∶冰醋酸（3∶1）固定液中，4℃冰箱中固定 3-24h。 4 制片：取 2-3 个根尖放在从冷冻蒸馏水中取出的干净载玻片上，加 1-2 滴固定液，用镊子将其捣碎，除去大块组织，再加一滴固定液在材料上，而后将载玻片置于酒精灯火焰上烘干。 5 染色：制好的片子用 20∶1 的 Giemsa 染液（用 PH7.0 ,1/15mol/L 磷酸缓冲液配制）染色 20min 左右，再用蒸馏水冲洗后晾干，完全干燥后镜检。 6 选那些分散染色体分散、清晰，并且较直的制片进行显微摄影、胶卷冲洗、照 片放大，每种材料观察选出约 10 个细胞进行核型分析。 [1]朱凤绥,林汝法，李永青等.荞麦不同类型的染色体研究初报.细胞生物学杂志， 1984,6 3 :130~131 [2]朱凤绥. 植物染色体Ｆ-BSG 法分带方法与带型.遗传，