酵母细胞的收集分析.pptVIP

* 酵母细胞的收集 目标： 从酿酒酵母培养液中收集酵母细胞。 原理： 酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。本法先采用离心法收集新鲜酵母细胞，再采用菌体自溶方法来破碎细胞壁，使细胞内的蔗糖酶释放出来。 操作方法： ——酵母细胞的收集 在50ml塑料离心管中装入45ml新鲜酿酒酵母发酵液，3000转/分钟离心10分钟，小心移除上清液。再往离心管中加30ml无菌生理盐水，震荡离心管。使酵母细胞沉淀重新悬浮与液体中，3000转/分钟离心10分钟，小心移除上清液，得到新鲜的酿酒酵母细胞沉淀。 实验结果： 酵母细胞沉淀结果为：0.94g 注意点： 使用离心机时注意平衡问题，使用离心管前应先称量空离心管质量。 结果分析： 酵母菌达不到25g，没达到要求。 酵母细胞的自溶 目标： 从酿酒酵母液中收集酵母细胞，并使之自溶。 原理： 酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。本法先采用离心法收集新鲜酵母细胞，再采用菌体自溶方法来破碎细胞壁，使细胞内的蔗糖酶释放出来。 操作方法： ——酵母自溶 在收集有25g酵母细胞沉淀的500ml三角瓶中加入醋酸钠1.6g，搅拌15~20分钟，使团块的鲜酵母液化，加1.5甲苯，用保鲜膜密封瓶口，摇动10分钟使甲苯和酵母液充分混匀，加入37℃培养箱中保温60小时，使酵母自溶。 实验结果： 细胞自溶：破碎细胞壁 细胞自溶结果为：35.9g 酵母蔗糖酶粗液的制备 目标 从酿酒酵母细胞破碎液中制得蔗糖酶被提液A 原理 酿酒酵母细胞破碎后，经过细胞碎片分离提取蔗糖酶液，再经热提取和乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯 操作方法 在培养物中取出装有已自溶酵母的三角瓶，加30ml蒸馏水，摇匀，倒入50ml塑料离心管，10000转/分钟20min,经离心后，离心管中的悬浮液分3层，上层为浆状的固体，下层为固体，中间层为液体，小心仔细取出中间层液体，重新倒入离心管中10000转/分钟离心20min,仔细取出上清液并用量筒测出体积记为VA，取出3ml保存（做好标记），用等以后的活力和蛋白质含量的测定，所提取的液体为初提取液A 实验结果： 蔗糖酶初体液A为11.2ml 注意事项： 要注意离心管的重要配平 蔗糖酶的提取及初提纯 目标 从酿酒酵母细胞破碎液中制得蔗糖酶初提液A、热提取液B和乙醇沉淀提取液C。 原理 酿酒酵母细胞破碎后，经过细胞碎片分离提取蔗糖酶液，再经热提取和乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。 操作方法 热提取液B 将初提液A倒入50ml三角瓶中，加3.2ml 4N醋酸，使溶液的pH值约为4.5左右，摇匀，迅速在水浴中加热至50℃，保温30分钟（注意温度绝对不能超过50℃），在保温的过程中不断摇动三角瓶，取出后迅速在冰浴中冷却，冷却液在离心机中10000 rpm离心15分钟，仔细地取出上清液并用量筒测出体积记为VB，此提取液为热提取液B，取出3毫升保存（做好标记），用于以后的活力和蛋白质含量的测定。 乙醇沉淀提取液C 将热提取液B倒入100毫升烧杯中，把烧杯放入冰浴中，轻轻搅拌并慢慢加入（-20℃）95%乙醇溶液，体积与热提取液B相同。整个过程不少于30min，再继续搅拌10min，将烧杯内的液体全部移入离心管中（白色固体保留待用），15000 rpm离心10min。离心后，仔细地倒掉上层清液，用5ml 0.05M Tris-HCl（pH7.3）缓冲液把烧杯中的白色粘状固体溶解，倒入离心管搅拌使离心管内的白色固体溶解，15000rpm离心10min，取上层清液即为乙醇沉淀提取液C，测量其体积记为VC，取出3ml保存（做好标记），用于以后的活力和蛋白质含量的测定。 实验结果 蔗糖酶纯化的热提取B为9ml，乙醇提取液C为5.4ml，第二次离心为16.4ml 蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法 目标 采用离子交换层析法，从乙醇沉淀提取液C中进一步纯化得到蔗糖酶的柱层析分离组分。 原理 本法所用的Q Sepharose凝胶是以琼脂糖作为不溶性母体引入季铵型集团，为强阴离子交换剂。Q Sepharose凝胶交换介质载量高，分辨率高，能承受较高的流速，化学稳定性好。在pH7左右时，Q Sepharose凝胶带正电，而一般蛋白质在此pH值范围带负电，两者可结合，降低pH或提高离子强度均可使之洗脱下来，当被吸附的蛋白质的Kd值有差异时，达到分离的目的。 操作方法 1、离子交换柱的填充 取1支内径1cm、高30cm的层析柱垂直固定，下端的橡皮管用夹子夹紧，先在柱子内加入5mL蒸馏水。将