FCM样本制作.ppt

免疫学实验中心 免疫学实验中心 流式细胞术的样品制备 凡是能被荧光素标记的且这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发的细胞或颗粒，都可用流式细胞仪检测。在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的一机多用的仪器。 流式参与研究的学科种类 应用流式发表的论文统计 流式细胞仪的特点 单个细胞分析 同时多参数分析 速度快：10000个细胞/秒 统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况 分选感兴趣的细胞 流式细胞仪的散射光信号 流式细胞仪的散射光信号 FSC:表示细胞大小 SSC:表示细胞内颗粒的复杂程度 荧光信号 荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为 振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子 荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强 荧光染料的特性 荧光素的选择 3. 抗原丰富度决定荧光素的选择 高密度表达的抗原我们可以应用任何荧光素标记的抗体来检测，低密度表达的抗原就需要我们应用高信噪比高的荧光素 例如：细胞表面的CD3 细胞产生的IFN-? 可以用任何荧 光素标记的抗体 而IL-4则最好用APC等高信噪比的荧光素标记的抗体 抗体的选择 首选直接标记抗体 荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原 间接标记：一般不提倡用 实验标本的处理 单细胞悬液的制备：胰酶消化 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体 Intracellular Cytokine-Protocol 上机, 检测、分析 细胞周期 A typical DNA Histogram 刚加入胰酶，细胞仍呈致密单层 细胞开始皱缩但不明显，仍维持细胞正常形态 细胞基本皱缩变圆，此时细胞吹打可下 细胞完全皱缩变圆，此时应弃去胰酶，加入培养基后轻摇可将细胞从细胞瓶壁上洗下 4.加入染色缓冲液（PBS+1%BSA），反复吹打，使之成为单细胞悬液 5.移入离心管内，离心 1000-1500rpm 5min 6.弃上清，重悬管内细胞后，加染色缓冲液，洗涤细胞 二、实体组织分散成单个细胞 机械法 剪刀剪碎、手术刀切碎、匀浆器匀浆、尼龙网或者不锈钢网 酶处理法 胰酶、胶原酶 溶菌酶 木瓜蛋白酶等等 单纯采用机械或者酶处理法效果都不太理想，往往是将两者结合 实体瘤分散试验实例： 1.从动物身上取瘤后，立即投入4度含有10％NCS的培养介质中 2.取0.2～0.5g瘤组织并切碎 3.切碎瘤组织放入混合酶液中（DNA酶＋胶原酶＋链霉蛋白酶） 4.37度 消化30－60min 5.过滤，离心，弃上清 6.用含10％NCS的培养介质洗涤细胞2次 7.重悬细胞 300目或者400目（37um）滤网过滤 目x孔径＝15400 单细胞悬液的处理 根据实验目的的不同，处理过程亦不相同 细胞表面标记分子检测 胞内细胞因子分析 细胞周期分析 细胞早期凋亡分析 细胞表面标记分子检测－淋巴细胞亚群分析 抗凝外周静脉血 10～30ul 染色 溶血剂溶血 染色缓冲液洗涤 1％PFA固定15分钟 上流式检测 不加任何抗体 空白对照 1 Anti-CD3-FITC 调补偿管 2 Anti-CD4-PE 调补偿管 3 荧光抗体 检测项目 管号 antiCD3FITC+CD16/56PE NK cell 8 antiCD3FITC+CD19PE B cell 7 antiCD3FITC+CD8PE CD8+T 6 Anti-CD3FITC+CD4PE CD4+T 5 IgG1-FITC /IgG2-PE 同型对照 4 淋巴细胞亚群报告模式 CD4+ CD8+ 胞内细胞因子分析－PBMC产生IFN-?测定 取抗凝外周静脉血 1ml PMA+Ionomysin 37℃4h Monosin 37℃ 2h 收集细胞，洗涤， 表染 溶血、洗涤、固定 破膜、胞内细胞因子染色 洗涤，加1%PFA，检测 检测组 未激活对照 激活对照 同型对照 空白对照 Anti-IFN-?-FITC 5 Anti-IFN-?-FITC 4 CD69-FITC 3 IgG1-FITC 2 — 1 荧光抗体 管号 细胞周期分析-PI染色测细胞周期 获取单细胞悬液，洗涤 70%冷乙醇 4℃ 2h RNase A 悬浮消化 30min PI 染液作用 4℃ 30min 筛网过滤 检测组 空白对照组 PI 2 — 1 荧光素 管号 上机检测 G1 M G2 S Quiescent cells G0 All rights reserved by Dr Baiqing LI * Bengbu Medical College Department of Immunology ? by Dr B