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2．徒手分割法 主要适用于分割体积较大的胚胎，其优势在于可以不用显微操作仪。在立体显微镜下，用直径略小于胚胎的毛细管吹吸胚胎从透明带中脱出。手持玻璃针自上而下对称切割裸胚。该方法操作简便、快速，便于生产应用，但要求要有较为灵巧的操作技能。 三、胚胎分割存在的问题 胚胎分割产生的后代初生体重低，分割胚即使培养到囊胚阶段与正常胚胎相比，细胞数明显减少。 同一胚胎切割后获得的后代，在理论上遗传性状应该完全一致，但事实并不这样。人们发现胚胎分割后，同卵双生犊牛的毛色和斑纹并不完全相同，而在2细胞阶段分割，却表现出遗传一致性。 最后还存在同卵多胎的局限性。由一枚胚胎通过胚胎分割方式获得的后代数量有限。迄今，最好的结果是由一枚牛胚胎获得3个牛犊，这说明孪生胚胎的发育潜力很有限。 第四节 体外受精技术 体外受精是指通过人为操作成熟的卵子与精子在合适的体外环境中完成受精过程。它的基本原理是在人工模拟体内环境，包括营养、温度、湿度、气体、渗透压、pH等，使卵丘卵母细胞复合体中的初级卵母细胞成熟，同时使精子获能并完成受精。 人工受精与体外受精的主要区别？ 人工受精与体外受精的区别与联系 体外受精技术对动物生殖机理研究、畜牧生产、医学和濒危动物保护等具有重要意义。 还是哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分。 一、体外受精技术的发展简史 1878年：德国人Scnenk以家兔和豚鼠为材料，开始探索哺乳动物的体外受精技术，但一直没有获得成功。 1951年：美籍华人张明觉和澳大利亚人Austin同时发现了哺乳动物的精子获能现象，这一领域的研究才获得突破性进展。 1959年：张明觉以家兔为实验材料，从一只交配后12h的母兔子宫中冲取精子（即体内获能的精子），从另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中收集卵子，精子和卵子在体外人工配制的溶液中完成受精过程，然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受体的输卵管中，其中4只妊娠，并产下15只健康仔兔，这是世界上首批试管动物，它们的正常发育标志着体外受精技术的建立。 20世纪60年代初至20世纪80年代中期，人们以家兔、小鼠和大鼠等为实验材料，进行了大量基础研究，在精子获能机理和获能方法方面取得很大进展。 试管小鼠（1968）、大鼠（1974）、婴儿（1978）、牛（1982）、山羊（1985）、绵羊（1985）和猪（1986）等相继出生。 二、体外受精技术的基本操作程序 哺乳动物体外受精的基本操作程序，主要环节包括以下几个方面： 1、卵母细胞的采集和成熟培养 （1）卵母细胞的采集 活体卵巢上采集：这种方法是借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。 一头健康母牛每周可获得5~10枚卵子。 屠宰后卵巢上采集:这种方法是从刚屠宰母畜体内摘出卵巢，经洗涤、保温（30℃-37℃)后，快速运到实验室，在无菌条件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直径卵泡中的卵母细胞（牛卵泡直径要求3-10mm）也可对卵巢进行切片，收集卵母细胞。 （2）母细胞的选择 采集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵丘卵母细胞复合体,要求卵母细胞形态规则，细胞质均匀，外围有多层卵丘细胞紧密包围。 常把未成熟卵母细胞分为A、B、C和D四个等级。A级卵母细胞要求有三层以上卵丘细胞紧密包围，细胞质均匀；B级要求卵母细胞质均匀，卵丘细胞层低于三层或部分包围卵母细胞；C级为没有卵丘细胞包围的裸露卵母细胞；D级是死亡或退化的卵母细胞。 一般只培养A级和B级卵母细胞。 （3）卵母细胞的成熟培养 由超数排卵采集的卵母细胞已在体内发育成熟，不需培养可直接与精子受精，对未成熟卵母细胞需要在体外培养成熟。 2、精子的采集与体外获能 哺乳动物精子的获能方法有培养和化学诱导两种方法。牛、羊的精子常用化学药物诱导获能，诱导获能的药物常用肝素和钙离子载体。 3、体外受精 将获能的精子和成熟的卵子置于受精液中共同培养，除钙离子载体诱导获能外，精子和卵子一般在获能液中完成受精过程。受精培养时间与获能方法有关。 4、受精卵的体外培养 体外受精的早期胚胎在体外发育过程中，往往会停滞在某一阶段不再发育，此种现象称之发育阻断。 用体细胞与胚胎在微滴同培养，利用体细胞生长过程中分泌的有益因子，促进胚胎发育，克服发育阻断。 受精卵的发育过程 动物体外受精程序 精子