高级生物化学2.docxVIP

等电聚胶电泳(IFE)：利用一种特殊的缓冲液(两性电解质)，在聚丙烯酰氨凝胶制造一个pH梯度，电泳时，每种蛋白质迁移到它的等电点(pI)处，即梯度的某一pH时，就不再带有净的正负电荷了。 蛋白质一级结构: 蛋白质的多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键位置 测定蛋白质一级结构的一般步骤: 测定蛋白质分子中的多肽链数目-拆分蛋白质分子的多肽链--测定多肽链的氨基酸组成 -测定多肽链的C端和N端残基-断裂多肽链内的二硫键-用两种以上的方法将多肽链断裂为数个肽段 -测定个肽段的氨基酸顺序-用拼版法确定多肽链的氨基酸排列顺序-确定肽链间的二硫键 测序步骤：(1)纯化蛋白质 (2)拆分多肽链、断开二硫键 [还原法：β-巯基乙醇、碘乙酸；氧化法：过甲酸；变性剂：高浓度尿素溶液] (3) 测定多肽链的氨基酸组成 (4) N末端和C末端的氨基酸测定 [N端：Sanger法，DNFB+氨基酸——DNP(黄色)+HF；DNS(丹磺酰氯)法，产生强烈荧光；Edman法，PITC+氨基酸——PTH-AA(能溶于有机溶剂)；氨肽酶法，就是用这类肽链外切酶从多肽链的N端逐个的向里切。C端：肼解法、还原法和羧肽酶法] (5)两种以上方法专一性的裂解成两套以上肽段 [酶解法：胰蛋白酶(水解Arg、Lys)、胰凝乳蛋白酶(水解Phe、Tyr、Trp)；化学法：溴化氢专一性的水解Met、羟胺法] (6) 分别将肽段纯化，测出其氨基酸顺序 [Edman降解法、DNS- Edman降解法、蛋白质测序仪等] (7) 片段重叠法拼凑出整条多肽链氨基酸顺序 (8) 确定多肽链中S—S交联桥的位置 蛋白质的二级结构: 在规则氢键指导下，局部主肽链在空间的排列 种类 1.螺旋（helix）表示为“nsR或L” 其中n表示上升一圈的氨基酸残基数，s表示氢键形成的环中所含的原子数，R或L表示螺旋的旋转方向 2 ?－折叠片 3.回折4.β—发夹5.无规则卷曲6.三股螺旋7.?–突起 蛋白质的超二级结构：是指相邻二级结构单元按一定规律组合，形成空间上可以区别的结构单位 类型：1.卷曲的卷曲α—螺旋2.βXβ单元3.β??迂回4.回型拓扑结构5.β－折迭桶6.α－螺旋－回折－α螺旋 结构域（doman）是指蛋白质一条多肽链上出现的紧密的、相对独立的区域。 类型：（1）α－螺旋结构域（2）β－折叠结构域 （3）α+β结构域这种结构域中两种二级结构单元都存在，并且二者是随机出现的 （4）α/β结构域这种结构域中两种二级结构单元都存在，但是这两种二级结构单元是有规律的交替出现 （5）无规则卷曲结构域 （6）β－回折结构域 结构域间的结构关系：从空间结构看结构域之间有的只是通过一条柔软的肽链连接，而有的接触面比较大。从一级结构上看，每个结构域在一级结构上都是连续的，即结构域之间只是通过一条肽链连接的。 蛋白质三级结构（tertiary structure）是指蛋白质分子中全部原子的空间排列。 特点：首先，球状蛋白往往利用各种结构单元折叠成紧密的球状结构 其次球状蛋白质分子的疏水基团主要趋向于内部，而亲水基团主要分布于表面其次球状蛋白质分子的疏水基团主要趋向于内部，而亲水基团主要分布于表面第三、蛋白质表面的下陷区往往是蛋白质执行功能的部位，第四，同类球状蛋白，具有基本相同的三级结构，不同的球状蛋白，其三级结构是不同的。 球状蛋白的分类：1.全α-结构蛋白质2. α，β -结构蛋白质3.全β-结构蛋白质4.富含金属或二硫键（小的不规则）蛋白质 蛋白质的四级结构（quaternary structure）就是亚基在空间的排列方式 四级结构的优越性：减少遗传错误，其次可以扩大功能，节省模板，形成一定的几何构型，从而形成特殊结构的蛋白质。 蛋白质的结构原则：1手性原则（handed principle）：蛋白质从低级结构形成高级结构时要遵从右手原则 2、疏水表面积最小原则。蛋白质形成三级结构时，要使其疏水的表面积尽量达到最小，这样有利于蛋白质学细胞中的稳定。3、自我装配原则。新合成的肽链只是线性结构，从这样的结构形成特定的空间结构，要经过精细的装配过程。 血红蛋白的变构效应血红蛋白从脱氧状态（脱氧血红蛋白）转变为氧结合状态（氧合血红蛋白）过程中其空间结构要发生变化 波尔（Bohr）效应——H+、CO2对血红蛋白结合氧的影响 相对离心力(relative centrifugal foceRCF) RCF = 1.119×10-5×（r/min)2×r×g 图表法根据旋转半径（r）、RCF、r/min 的列线计算图进行换算 离心机 (centrifuge)1. 制备离心机 根据其最大转速可以分为以下几种： 普通离心机：最大转速 6 000r/min， 最大相对离心力6 000×g用途：固液沉