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FRET 原理 Principle 荧光标记 利用FRET技术检测不发光分子间相互作用的策略 * * 陈 同 生 华南师范大学信息光电子科技学院 荧光共振能量转移 Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET 分子能级与荧光 S0 S1 T1 hn0 hn1 hn2 2. 荧光（Fluorescence ：当处于基态的分子吸收光能后进入激发态，并且立即返回基态并以光的形式释放能量，这种光称为荧光。 4. 激发 Excitation, Ex 和发射 Emission, Em 光谱（Spectra : 1. 能级（ Energy Level）：原子的可能状态是不连续的，因此各状态对应能量也是不连续的。包含电子能级、振动能级和转动。 3. 磷光（Phosphorescence）:分子从激发三线态返回基态以光的形式释放能量。 CFP Ex. 440nm Ex. 470nm Em. 470nm YFP Em. 535nm 荧光共振能量转移 FRET 现象 3. FRET现象的特征: 选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光 1. 供体 Donor, D Donor 2. 受体 Acceptor, A Acceptor FRET的条件 发生FRET需要三个条件： 1、供体分子的发射光谱和受体分子的吸收光谱必须有显著的重迭，一般大于 30％； 2、供体分子和受体分子间的距离必须在 1 – 10 nm 之间. D和A间的FRET 效率： 3、供体分子的发射态偶极矩与受体分子的吸收态偶极矩、以及它们的向量必须满足一定的条件 R0: E 50%时供体和受体分子间的距离.对于特定的供体受体对是常数; R: 供体和受体分子间的距离. E: FRET效率. 对于R特别灵敏. 举例: 假设 R0 5nm, 1） R 10nm, E 1.5% 2） R 5nm, E 50% 3） R 6nm, E 25% 450 500 550 600 l nm D Em A Ex 1 蛋白分子的共定位; 2 蛋白分子聚合体; 3 转录机制; 4 转换途径; 5 分子运动; 6 蛋白折叠等生物学问题. FRET的应用 通过 FRET 技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息。常用于解决如下问题: Laser Laser D A FRET技术应用一:检测两个发光分子间的重合与共定位 FRET技术应用二: 检测分子间的相互作用 Laser Laser FRET技术应用三: 检测分子的折叠与构象变化 FRET技术应用举例：细胞内钙离子浓度的实时测量 Miyawaki A, et al., Nature 1997, 388:882-887 b BFP-GFP BFP-YFP CFP-YFP CFP-dsRED GFP-dsRED 在FRET实验中经常使用的 供体-受体荧光分子对 2. 绿色荧光蛋白类 Green Fluorescent Proteins, GFPs 1.染料类 Dye FITC-Rhodamine Alexa488-Cy3 Cy3-Cy5
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