第五章基因与克隆载体的体外重...程序.pptVIP

目的基因与克隆载体的体外重组 基因重组克隆与亚克隆 体外连接重组DNA分子的特点： （1）DNA体外连接减少了 DNA分子进入宿主细胞后遭受降解的危险，增加了转化效率； （2）由于限制性内切内产生的粘端在体外连接，使原来酶的识别序列在整个DNA中维持完整性，有利于在重组子转化扩增后再对外源基因进行分离； （3）连接时可控制连接反应条件，有利于形成环状分子或者几个DNA片段头尾相连接的直线多联体。 把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体，例如从重组的λ噬菌体克隆到质粒，或者从某种质粒克隆到另一种质粒，这种过程称为亚克隆。亚克隆通常是将较大的克隆片段经酶切后，再将所有的小DNA片段与另一载体连接、转化的程序。 基因重组对载体的要求与载体类型 选用克隆载体还是表达载体？ 表达型载体是能够使外源基因在宿主细胞内进行高效率表达的载体，一般要有强启动子和正确的终止子，能够高效地高拷贝地转录目的基因并且产生稳定的mRNA。 强启动子组建的高表达载体一般有三类： （1）含λ噬菌体的pL启动子的质粒： λ噬菌体的pL启动子是一个很强且容易调控的启动子。温度敏感型载体。 （2）含Lac启动子的质粒： Lac启动子是LacZ基因前的一个强启动子。 （3）含trp启动子的质粒： trp启动子是大肠杆菌色氨酸操纵子中的强启动子。 DNA体外重组是将目的基因（外源DNA片段）用DNA连接酶在体外连接到合适的载体DNA上，这种重新组合的DNA称为重组DNA。主要依赖于限制性内切酶和DNA连接酶。 考虑因素： 1.步骤尽可能简单； 2.连接形成的接点序列，应能被某种限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段； 3.对转录和转译过程中密码结构的阅读应不发生干扰。 目的基因与质粒载体的连接 粘性末端连接法 定向克隆法 平末端连接法 同聚物加尾法 加人工接头连接法 加DNA衔接物连接法 粘性末端连接法 一般程序：选用一种对载体DNA只具惟一限制位点的限制酶（如EcoR I）作位点特异切割。经此酶消化之后就会形成全长的具粘性末端的线性DNA分子。再将外源DNA大片段也用同一种限制酶作同样的消化，随后，把这两种经过酶切消化的外源DNA和载体DNA混合起来，加入DNA连接酶，由于具有相同的粘性末端，因此能够退火形成双链结合体。 防止载体自身再环化 由限制酶产生的具有相同粘性末端的载体DNA分子，在反应混合物中会发生自身环化作用，也有可能形成串联寡聚物，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合的环状结构。 调整两种DNA的浓度； 用碱性磷酸酶（BAP或CIP）处理线性载体DNA分子，去除线状载体DNA两末端的5’磷酸基团。 定向克隆法 当用两种不同的限制性内切酶（BamH I和EcoR I）消化外源DNA时，可以产生带有非互补突出末端的外源DNA片段，此片段可采用所谓的定向克隆（directional cloning）法，即只以一个方向很容易的将其插入到同样用BamH I和EcoR I进行消化而产生匹配粘端的载体中。 平末端连接法 由T4噬菌体DNA连接酶催化，但属于低效反应。 平末端需具备4个条件： （1）极高浓度的T4噬菌体DNA连接酶； （2）高浓度的平末端外源DNA和质粒DNA； （3）低浓度（0.5m mol/L）的ATP； （4）不存在亚精胺一类的多胺。 同聚物加尾法 利用末端脱氧核苷酸转移酶可催化dNTP加到单链或双链DNA 3’-OH端的能力，在目的DNA和质粒载体上加入互补同聚物，两者再通过互补同聚物之间的氢键形成可转化大肠杆菌的开环重组分子。 由于poly（dA）同poly（dT）， poly（dG）同poly（dC）不等长，重组DNA分子上便会留有缺口或裂口，需用Klenow片段去填补，然后用DNA连接酶封闭裂口。 同聚物尾巴长度超过10个核苷酸，则碱基对结构相对稳定。未完全连接的重组体分子可直接导入受体细胞，由寄主细胞内部的DNA聚合酶和DNA连接酶进行修复。 人工接头法 人工接头是化学合成的两个自相互补的核苷酸寡聚体（10-12bp），而两个寡聚体可形成带一个或一个以上限制酶切位点的平末端双链寡核苷酸片段。人工接头的5’-末端先用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，在通过T4DNA连接酶的作用使人工接头与待克隆的平末端DNA片段连接起来。接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子，使二者都产生出彼此互补的粘性末端，按照常规的粘性末端连接法形成重组子。 ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧ　　　　　 ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ　　　　　　　　　　　　　　　 　 ＧＧＣＴＴＡＡＧＣ