第五章细胞工程制药程序.ppt

（四）中草药生产工程 目前工业化细胞培养的中草药品种有：人参、烟草、长春花、雷公藤、鸡血藤等 （三）药用植物细胞的大规模培养 1.有适宜于植物细胞生长和生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统 2.技术上，满足3个条件： 培养的细胞遗传上是稳定的； 细胞生长及生物合成的速度快，终产物产量高； 代谢产物在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中 （三）药用植物细胞的大规模培养 药用植物细胞规模化培养技术： （1）两步培养法 （2）固定细胞培养法 （3）两相培养技术 （4）毛壮根培养技术 （5）冠瘿培养技术 （6）反义技术 药用植物细胞规模化悬浮培养操作 （1）批量培养（2）连续培养 药用植物细胞规模化培养工艺（如下图） 目标植物、优良植物、外植体选择 愈伤组织诱导 有效成分检测 高产细胞株筛选 固体培养 液体培养 小型发酵罐培养（研究适宜的生长条件） 培养条件优化 器官分化（毛壮根） 大型发酵罐大量培养 次生代谢产物的提取、分离、纯化和精制 包装 药用植物细胞规模化培养工艺流程 （1）培养基的选择： 基本培养基 生长调节物质：细胞生长素/细胞分裂素、水解酪蛋白、脯氨酸、谷氨酰胺 诱导剂的添加 前体物质的添加 抗褐变剂的选择 抑制剂的添加 ； （2）外植体和高产细胞株的建立： A. 分散性好，适于工业化操作；均一性好，细胞状态同步；细胞中次生代谢物含量高；细胞生长和次生产物合成能力稳定 B、从生理、生化和遗传的角度综合筛选高产细胞系： 广泛采集属内和科内不同种、不同年龄、不同地点、不同器官的高含量亲本株的外植体诱导新的愈伤组织，建立新的无性细胞系 研究细胞低密度培养技术，建立植板法及细胞团块法快速筛选高产细胞株； 采用特定培养基定向富集筛选，获得激素自养型及耐受高剂量细胞毒化剂的驯化剂；建立有利于高产细胞株种质稳定的继代培养方法 （3）选择适宜的物理因素： 光照、pH、通气状况、培养体系的物理性质、接种量，其中氧气与二氧化碳的调节、泡沫和表面粘附性、剪切力 （4）扩大培养：经常鉴定细胞株、纯化 （5）培养技术的选择：技术基础、成本、细胞生长和产物积累；反应器、培养方式 五、植物细胞培养的实例 （一）三七细胞培养工艺 （二）西洋参细胞培养工艺 （一）三七细胞培养工艺 1、培养基 2、三七种质材料的选择和处理 3、愈伤组织诱导及培养 4、细胞悬浮培养 5、三七细胞工程化大量培养 6、细胞收集以及干燥 MS培养基（Murashig and Shoog）单位（mg/L） NH4NO3 1605 KNO3 1099 CaCl2-2H2O 440 MgSO3-7H2O 370 KH2PO4 170 H3BO3 6.2 MnSO4-4H2O 22.3 CoCl2-6H2O 0.025 CuSO4-5H2O 0.025 ZnSO4-7H2O 8.6 Na2MoO4-2H2O 0.25 KI 0.83 FeSO4-7H2O 27.8 Na2EDTA-2H2O 37.3 VB1 0.4 VB6 0.5 烟酸 0.5 肌醇 100 甘氨酸　 2.0 蔗糖 30000 PH= 5.6-5.8 2、三七种质材料的选择和处理 取３－４年生的三七植株粗根，自来水充分洗净 ↓ 用７０％乙醇冲洗表面后切成小块，在７０％乙醇中浸泡２min ↓ 再转移至０.１％的升汞溶液中浸泡２０min ↓ 然后再用无菌水冲洗４―５次，备用 3、愈伤组织诱导及培养 将上述无菌三七粗根小块组织接种于含2ppm的 2、4-D+0.5ppm细胞激动素（KT）+10%椰乳的MS培养基之中，于25℃的CO2培养箱中培养40d，即可形成小的愈伤组织。 ↓ 然后每隔30d进行一次移植继代培养，经过多次移植继代培养便可形成多个愈伤组织无性系。 4、细胞悬浮培养 培养基为1ppm的2、4-D+0.5ppm细胞激动素（KT）+10%椰乳的MS培养基，pH=5.8，100ml的三角烧瓶之中装培养基25ml，于121℃高压灭菌20min。 ↓ 冷却后按1-2g/L的干重接种愈伤组织，愈伤组织切成干重每小块1mg，于25℃摇床中，以120转/分钟（振幅为2.5cm）振摇培养30天，即得三七悬浮细胞培养物。 5、三七细胞工程化大量培养 培养基与细胞悬浮培养培养基相同，在10L搅拌反应罐中加入培养液，培养液充满系数为0.75-0.8，灭菌后冷却至室温，接种已经培养25-30天的悬浮培养细胞，接种量按干细胞计