美兰试验和大肠杆菌生化鉴定试验方案.docVIP

一、美兰试验 1.试剂：亚甲基蓝水溶液：0.01g/300ml 美兰、乙醇、四氯乙烷、醋酸、蒸馏水。 2.仪器：试管：20mm*200mm 水浴锅：可恒温到38℃ 显微镜、测微尺、大头针、载玻片、数字式微量注射器 3.步骤 3.1试验准备 美兰染色液的配制：在圆底烧瓶中加入54ml 乙醇、40ml四氯乙烷，加热至70℃ ，加入1.2g 美兰，强烈摇动，使之迅速溶解，冷却后，徐徐加入 6ml醋酸，然后塞上密封塞，放于棕色瓶中，贮存于干燥冷暗处备用。每次倒出一定量放在染色缸里使用。 （1）吸取10ml牛奶于灭菌试管中，在水浴中加热到38℃，再加入亚甲基蓝溶液1ml,混匀。 （2）将试管放入水浴中，每30min观察一次褪色情况，并记录每个样品褪色时间。 褪色时间相当于每毫升牛乳中的细菌总数 20min 2*107次方 1.0*107-2.0*107次方 40-1h 5.0*106-1.0*106 1-2h 4.0*106-5.0*106 2-3h 3.0*106-4.0*106 3-4h 2.0*106-3.0*106 5-5.5h 5.0*105-1.0*105 5.5-6.5h 3.0*105-5.0*105 6.5-7.5h 1.0*105-3.0*105 7.5h 1.0*105 细菌总数平板计数 1试剂: Terrific肉汤 又称TB培养基 配制每升培养基，在900ml去离子水中加入： 胰化蛋白胨 12g 酵母提取物 24g 甘油 4ml 摇动容器使溶质完全溶解。然后在15psi 1.05 kg／cm2 高压下蒸汽灭菌20min。当溶液冷至60℃或60℃以下时加入100ml无菌的0.17mol/L KH2PO4，0.72mol/L K2HPO4溶液[该溶液的配制方法是：用90ml去离子水溶解2.31g KH2PO4和12.54g K2HPO4，完全溶解后，用去离子水定容至100ml并在15psi 1.05kg／cm2 高压下蒸汽灭菌20min。 设备:培养皿、试管、锥形瓶、1ml、10ml移液管、恒温培养箱 步骤： 制样：取25ml样品，加入225ml水中，充分混匀，制成1：10样品匀液 稀释：取5支试管分别加入9ml蒸馏水，取1ml样品加入第一个试管，充分摇匀，再取1ml一号试管溶液加入第二支试管摇匀，依次加入制成10倍梯度稀样。 培养：选取3个连续稀释度，各取1ml加入灭菌培养皿，再加入Terrific肉汤，在36℃培养2—3天。 计数：选取细菌总数在30-300之间进行计数。 二、大肠杆菌的生化鉴定实验 1 设备和材料 温箱：36±1 冰箱:0～4恒温水浴 :44.5±0.5 天平 显微镜均质器或乳钵 平皿:直径为90mm 试管 吸管 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL 玻璃珠:直径约5mm 载玻片 酒精灯 试管架2 培养基和试剂 乳糖胆盐发酵管:伊红美蓝琼脂平板: 乳糖发酵管:磷酸盐缓冲稀释液 生理盐水。 革兰氏染色液3.1 检样稀释 3.1.1 以无菌操作将检样25mL放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内 瓶内予置适当数量的玻璃珠 或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。 3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。 3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。 3.2 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖 胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1 温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。 3.3 分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1 温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。 3.4 证实试验 在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置 36±1温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。