酶工程实验讲义最终稿资料.ppt

凝胶层析的基本概念 外水体积（Vo） 内水体积（Vi） 基质体积（Vg） 柱床体积（Vt） 洗脱体积（Ve） 凝胶层析中的各种体积： 外水体积（Vo）：层析柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间流动相的体积。 内水体积（Vi）：凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。 基质体积（Vg）：凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积（Vt）：凝胶柱所能容纳的总体积。 Vt＝Vo＋Vi＋Vg 洗脱体积（Ve）：指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。 Kd是分配系数：用于衡量物质在凝胶内外的分配率，是凝胶层析的一个特征常数，只与被分离物质分子大小和凝胶孔径大小有关，与层析柱的长短粗细无关。 Kd值的计算：Kd=(Ve-Vo)/Vi 几个特征Kd值意义： 　　　①Kd=0,则Ve=Vo ，全排阻； 　　　②Kd=1,则Ve=Vo+Vi , 全渗入； 　　　③0＜Kd1,则Ve=Vo+Kd×Vi，部分渗入； 　　　④Kd1，则VeVo+Vi， Sephadex对它们有吸附作用。如某些芳香族化　　　　　 合物（Phe,Tyr,Trp等）， 优点： a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用 凝胶的类型： Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶 G-10 G-15 G-25 G-50 G-75 G-100 G-150 G-200 吸水量 （g/g干凝胶） 1.0 1.5 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 20.0 工作范围（肽与蛋白） 700 1500 5000 1500-20000 3000-70000 4000-150000 5000-300000 5000-500000 试剂：0.01mol/l 醋酸缓冲液（pH5.0） 器材：层析柱、部分收集器、核酸蛋白质检测仪 、记录仪、恒流泵 试剂与器材 操作方法 一、凝胶的选择与处理 1.凝胶及柱的选择 根据酸性磷酸酶的分子量选择Sephadex G150。 2.凝胶的处理 凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。 二、装柱 1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。 2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。 三、凝胶柱的平衡 通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。 四、加样 1.准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪 2.打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将酸性磷酸酶样品溶液1.5 mL小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1mL洗脱液冲洗管壁2次。最后加入3~4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒流泵，恒流泵另一端连通洗脱液，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连。 五、洗脱 洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.01mol/L的醋酸缓冲液，以每管3 mL/10 min流速洗脱，用自动部分收集器收集流出液。 梯度混合仪 层析柱 紫外检测仪 恒流泵 自动馏分收集器 记录仪 I II 六、收集酸性磷酸酶 收集带有光吸收的蛋白峰洗脱液，即为经凝胶过滤柱层析纯化的酸性磷酸酶。 七、测定 合并后的层析酶液，用实验三和实验四的方法测定其蛋白质含量和酶活力，计算酶的比活。与粗酶液及盐析后的酶液比较纯化前后单位质量的酶催化活性的变化 1、各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。 2、装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。 3、始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。 注意事项 结果处理 体积 活力单 位/毫升 总活