可溶性蛋白的测定—考马斯亮蓝法.docVIP

考马斯亮蓝G-250法 【原理】 考马斯亮蓝G－250 GooMAssIe BrIllIAnT Blue G－250 测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G－250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nM，后者在595nM。在一定蛋白质浓度范围内 1～100μg ，蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 　　【仪器与用具】 721分光光度计；10Ml量筒1个；研钵；烧杯；量瓶；移液管：1Ml 3支，0?1Ml 3支；10Ml具塞刻度试管14支。 【试剂】 标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白质100μg/Ml的标准蛋白溶液; 90%乙醇； 85%磷酸 W/V ； 考马斯亮蓝G-250溶液：称取100g考马斯亮蓝G-250，溶于50Ml 90%乙醇中，加入85%的磷酸100Ml，最后用蒸馏水定容到1000Ml，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。 　　【方法】 1 标准曲线 蛋白质含量为0～100μg/Ml 的绘制 取6支具塞试管，按表2-1数据配制含0～100μg/Ml的牛血清蛋白质液各1Ml。 表2-1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质液配制表 管号 1 2 3 4 5 6 蛋白质标准液（ml） 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水（ml） 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0 蛋白质含量（μg） 0 20 40 60 80 100 在每支试管中加入5Ml考马斯亮蓝G－250溶液，盖塞，反转混合数次，放置2Min后，用1CM光径比色杯在595nM下比色。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。 　2. 样品提取液中蛋白质浓度的测定 　（1）待测样品制备： 称取新鲜玉米籽粒2g放入研钵中，加2ml蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用2ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5-1h以充分提取，然后再4000r/min离心20分钟，弃去沉淀，上清液转入10ml刻度试管中，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。 （2）测定： 另取2支10ml具塞试管，吸取样品提取液1.0Ml，放入具塞试管中 每个样品设置两个重复 ，加入5Ml考马斯亮蓝G－250溶液，充分混合，放置2Min后在595nM下比色，记录吸光值，并通过标准曲线查得蛋白质含量。 3结果计算 样品中蛋白质的含量 Mg/g C×VTV1×FW×1000（2-2） 式中C：查标准曲线值 μg ；VT：提取液总体积 Ml ； FW：样品鲜重 g ； V1：测定时加样量 Ml 。