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第十六章 细菌基因工程 第一节 细菌基因工程的发展现状和发展趋势 细菌与基因工程关系密切 细菌是单细胞、结构简单的原核微生物，目前对其生理代谢途径以及基因表达的调控机制研究较为透彻 细菌的物种和代谢类型多种多样，对环境因子敏感，易于获得各类突变株 生长速度快，便于大规模培养，容易进行遗传操作 细菌基因工程的发展简史 1973年，波依尔(Boyer)和科恩(Cohen)首次完成外源基因在大肠杆菌中的表达 1982年，第一个基因工程产品──利用构建的基因工程菌生产人胰岛素获得成功，从此人类进入了生物技术的产业时代。 细菌基因工程的发展现状 1、细菌工程菌与人类药物生产 1982年美国首先将重组胰岛素投放市场，标志着世界第一个基因工程药物的诞生。 未来市场前景广阔的药品： 单克隆抗体、反义药物、基因治疗药物、可溶性蛋白质类药物和疫苗 细菌是生产蛋白药物的最好生物反应器 ①对化学方法难以合成的中间体进行合成，从而生产活力更强的衍生物，例如更高效的抗肿瘤药物羟基喜树碱和前列腺素 ②使微生物产生新的合成途径，从而获得新的代谢产物，例如去甲基四环素等 ③利用微生物产生的酶，对药物进行化学修饰，例如多种半合成青霉素的生产 ④生产天然稀有的医用活性多肽或蛋白质，如用于抗病毒、抗肿瘤的药物干扰素和白细胞介素等 2、细菌工程菌与环境保护 原理：采用现代分子生物学和分子生态学的原理和方法，充分利用环境微生物的生物净化、生物转化和生物催化等特性的功能基因，构建高效表达的基因工程菌进行污染治理、清洁生产和可再生资源利用 优点： 效率高、成本低、反应条件温、无二次污染，同时可以增强自然环境的自我净化能力。 应用范围： 工业和生活废水治理 重金属污染土壤的生物修复 (bioremediation) 农药残留的微生物降解 生物制浆和生物漂白 石油污染的消除 友好可再生材料的合成等 超级工程菌(superbug) 美国把降解芳烃、萜烃、多环芳烃的质粒转移到能降解脂肪烃的假单胞菌体内，培育出能同时降解4种烃类的“超级工程菌” ，降解石油烃类的能力比野生菌高几十倍乃至几百倍 “超级工程菌”是第一个获得美国专利的生物工程菌株 3、细菌工程菌与食品、饲料及其他工业 食品生产：利用生物技术构建的品质优良的食用乳酸杆菌能提高生产菌在食品发酵过程中的稳定性，改善发酵食品的质量并且降低了成本，大大缩短生产周期。 相关产品：酶制剂、氨基酸、维生素、增稠剂、有机酸、乳化剂、表面活性剂、食用色素、食用香精及调味料等 4、细菌工程菌与农业生产 各类农业微生物的应用是实现农业可持续发展和保护生态环境的有力保证。 由于自然菌株和传统技术本身的一些缺陷与不足，诸如研究周期长、成本高、活性低等，实现农业微生物的产业化受到很大限制 基因工程为微生物遗传改良提供了有效手段 第二节 细菌基因工程的表达系统 表达系统组成：外源基因、表达载体和宿主细菌。 1）表达载体(expression vector) 用来控制转录、翻译、蛋白质稳定性以及克隆基因产物的分泌等遗传元件。 2）宿主细胞： 大肠杆菌、枯草芽胞杆菌 酵母及动物、植物、昆虫细胞、动植物个体等 一 表达载体构建原则 表达元件的选择和利用 克隆载体：满足在宿主菌中复制和选择要求的载体。 质粒载体，整合载体。 大肠杆菌外的细菌中应用的克隆载体一般是穿梭载体，含有大肠杆菌克隆载体的序列，便于在大肠杆菌中扩增和制备。 例如，用于苏云金芽胞杆菌的克隆载体pHT304的基础骨架为大肠杆菌克隆载体pUC18, 另装有能在Bt中复制的质粒复制区序列ori1030和用于选择的红霉素抗性基因。 1. 启动子的选择 1）选择强启动子超量表达外源基因，最大限度地获得蛋白质产物。 如E. coli 中的lac、tac和T7等可调控强启动子 2）采用基因自身的启动子或宿主菌的相关性状基因的启动子表达关键基因，使宿主菌表现出一种特殊的性状，或启动其他产物的大量合成。 不一定要高量表达，只需正常表达。 2. 转录的有效性 在表达载体上设法除去衰减序列或插入抗转录终止序列以避免转录的提前终止，促使mRNA有效地延伸和终止。 在终止密码子后增加终止子序列，使转录有效终止，并延长mRNA的半衰期。 3. 翻译起始的有效性 翻译起始是多种成分包括mRNA、16SrRNA、fMet-tRNA，核糖体S1蛋白、蛋白合成起始因子之间的协同作用的过程。 要使翻译起始效率最高，要满足以下条件： ①选用最佳起始密码子AUG（偶尔为GUG和UU