第十章PCR技术分解.ppt

PCR基本原理 1、变性：加热使双螺旋的模板DNA分开，形成单链DNA 。 2、退火：降低温度，引物和DNA模板的互补区域形成局部杂交。 3、延伸：在模板链的指导下，DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸（dNTP）沿5’→3’方向加到引物上，形成新的DNA链。 4、以上三个步骤的循环。 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 原料（dNTP） dATP、dCTP、dGTP、dTTP 浓度：取决于扩增片段的长度 一般20～200 ?mol/L（浓度过高易产生碱基错配，浓度过低则降低反应产量；四种dNTP浓度应相等，任何一种偏高或偏低，也会引起错配） dNTP溶液小量分装，置-20℃冰冻保存，减少冻融次数 模板 单、双链DNA（RNA）均可。 纯度要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般50-100ng DNA模板/100?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 Tris-HCl（pH8.3~8.8）——调节pH KCl或(NH4)2SO4——促进引物退火 小牛血清白蛋白或明胶——稳定酶活性 甲酰胺——促进引物与模板配对， 特异产物增加，灵敏度增加 缓冲液： 可影响酶活性、解链温度、退火温度、扩增效率、扩增特异性和引物二聚体的形成等。 Taq酶活性需要Mg2+ ，Mg2+浓度过高导致非特异扩增。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200?mol/L时，Mg2+浓度为1.0～2.5mmol/L为宜。 注意：PCR体系中的dNTP、引物和模板的磷酸基都可以和Mg2+结合，从而降低游离Mg2+的浓度。 Mg2+: 反应条件： 预变性：94-98℃；破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构 变性温度和时间：94-98℃/30~60s； 退火温度和时间：50-65℃/30~60s； 原则：比引物Tm低3~5℃，或计算： 退火温度(℃)＝4(G+C)＋2(A+T)－(5～10) 延伸温度和时间：70-75℃（72 ℃ ）/1min(1kb)； 循环次数：一般为25-35次（次数过多，扩增效率降低，错误率增加） 扩增后延伸：72℃，4~10min，确保充分延伸。 模 板：反转录产物 2 ?l 底 物：dNTP（each 0.5mM） 2 ?l 引 物：上、下游引物（5?M） 各1 ?l 复制酶：Taq DNA聚合酶（5U/?l ） 0.2 ?l 缓冲液：10×buffer（含Mg2+) 2 ?l 灭菌ddH2O 11.8 ?l （20 ?l体系），混匀 PCR的反应体系（例） PCR反应条件： （1）预变性：94℃ 3min； （2）变性-退火-延伸循环： 94℃ 40s，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环； （3）循环后延伸、保存： 72℃ 5min；4℃ 保存。 是否为特异性扩增？ 依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。 PCR的扩增产物的检测 凝胶电泳分析　 凝胶电泳可以帮助判断扩增产物的大小及产量 2. 酶切分析　 既能进行产物鉴定，又能进行基因分型，还能进行变异性研究 3. 分子杂交分析　 分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法 4. 测序分析　 DNA测序是检测PCR产物特异性的最可靠方法，不仅能进行基因分型，还能进行变异性研究 PCR中应注意的事项 设立（无模板的）阴性、空白对照，可检测反应体系是否被污染。 设立阳性对照（GAPDH、β-actin），可检测反应体系是否被正常工作。 无目的DNA产生： 1）检查引物内或引物间是否存在配对； 2）降低退火温度，延长退火时间及延伸时间； 出现非特异扩增带 1）增加退火温度，减少退火时间及延伸时间； 2）降低引物及Taq 酶的量。 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果 PCR的类型和应用 研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分