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荧光蛋白标记亚细胞定位 扬州大学 生物科学与技术学院 扬州大学生物科学与技术学院 生物化学精品课程 扬州大学生物科学与技术学院 问题的提出 一直以来，人们已经掌握一些方法以评价蛋白的化学和物理状态 但是存在一些基础的问题，如何直接理解蛋白在细胞内的的生物活性，因此，我们需要在活细胞体内检测这些蛋白，以利用了解以下信息 2. 目的蛋白与哪些其他蛋白相互作用 1. 目的蛋白定位在什么地方? 这些问题能够通过以下实验揭示 1 蛋白荧光细胞定位 2 酵母双杂交，免疫共沉淀，荧光共振能量转移 荧光蛋白标记细胞定位 将目的基因与绿色荧光蛋白基因（EGFP）融合，通过绿色荧光蛋白的荧光效应以对目的蛋白进行亚细胞定位 P Target 启动子 目的蛋白基因 终止子 P Target EGFP 限制性内切酶位点 Linker poly-G 荧光亚细胞定位的设备: 激光共聚焦显微镜 激光共聚焦显微镜所发射的光能聚焦在样品的一个非常薄的切面上。 激光共聚焦显微镜的优点是其能剔除非焦平面来源的任意光线。 实验方法 克隆目的基因的开发阅读框 将目的基因与EGFP基因融合（在哺乳动物细胞中，一般选用pEGFP系列质粒载体） 将质粒转染细胞 在不同的时间点在激光共聚焦显微镜下观察EGFP在细胞中的定位，如有必要需进行亚细胞组分的染色，例如细胞核染色（一般可用PI, DAPI或Hochist ;内质网