20个测序常见的问题.docVIP

20个测序常见的问题 ? 1首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度. 2．如何提供菌液？如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以将培养好的4—5ml菌液沉淀下来，倒去上清以方便邮寄。同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破. 3．如何制作穿刺菌？用灭菌过1.5ml或2ml离心管加入LB琼脂 7g/L 斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达管底，不完全盖紧管盖适当温度培养过夜，然后盖紧盖子加封口膜，室温或4度保存。 4． PCR产物直接测序有什么要求？1 ．扩增产物必须特异性扩增，条带单一.如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果；.2）必须进行胶回收纯化；3）DNA纯度在16—2.0之间.浓度50ng/ul以上. 5．为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化？如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰。这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。大多所谓的PCR纯化试剂盒实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。 6．如何进行PCR产物纯化？PCR产物首先必须用Agarose胶电泳，将特异扩增的条带切割下，然后纯化。使用凝胶回收试剂盒回收.产物用ddH2O溶解。 7． PCR产物直接测序的好处？A PCR产物直接测序可以反映模板的真实情况.B 省去克隆的实验费用和时间.C PCR产物测序正确的片段进行下一步克隆实验使结果更有保障.D 混合模板进行PCR的产物直接测序可以发现其中的点突变. 8．对用于测序的质粒DNA的要求有哪些？对测序模板DNA的一般要求：1 .DNA纯度要求高，1.6—2.0之间，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等；2 .溶于ddH2O中，溶液不能含杂质，如盐类，或EDTA等螯合剂，将干扰测序反应正常进行。 9．如何鉴定质粒DNA浓度和纯度？我们使用水平琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入0.5ug/ml的EB 电泳缓冲液中不必加EB ，加一个已知浓度的标准样品。电泳结束以后在紫外灯下比较亮度，判断浓度和纯度。此方法可以更直接、准确地判断样品中是否含有染色体DNA、RNA等，也可以鉴别抽提的质粒DNA的不同构型。质粒DNA的3种构型是指在抽提质粒DNA过程中，由于各种原因的影响，使得超螺旋的共价闭合环状结构的质粒 SC 的一条链断裂，变成开环状 OC 分子，如果两条链发生断裂，就变成为线状 L 分子。这3种分子有不同的迁移率，通常，超螺旋型 SC 迁移速度最快，其次为线状 L 分子，最慢为开环状 OC 分子。使用紫外分光光度计检测，或者用溴乙锭-标准浓度DNA比较法只能检测抽提到的产物中的浓度，甚至由于抽提的质粒DNA中含有RNA、蛋白质、染色体DNA等因素的干扰，浓度检测的数值也是没有多少意义的。 10．为什么抽提的质粒最好溶解在ddH2O中？全自动荧光测序由于反应体系小，所以对于模板DNA的质量要求比手工测序高许多。通常的提取质粒的试剂盒会提供一个Elution Buffer给用户洗脱DNA，我们建议用户不要使用。因为其中含有的如EDTA等组分会对测序反应产生干扰，甚至导致测序反应失败。 11．对测序引物的要求有哪些？对测序引物的一般要求：1 .特异性与测序模板结合，不能有多于4个碱基以上的错配现象；2 .不能含有混合碱基；3 .长度17-25碱基；4 .纯度高，最好PAGE纯化；5 .用ddH2O溶解，不要用TE溶解。 12．为什么测序引物必须特异地与DNA模板结合？测序引物与待测样品DNA分子只能有一个结合位点是测序成功的前提。如果测序引物在DNA模板分子上有不只一个的结合位点，将造成测序反应过程中引物链在几个结合位点处同时扩增，从而得到链长相同而组成不相同的终止链，测序电泳时收集到重叠峰或乱峰，无法读取序列。 13．为什么测序引物3端以后有30-50碱基无法读到？全自动荧光测序方法由于使用标记了大荧光染料的ddNTP，一些未反应完的ddNTP底物会连同测序反应产物一并被沉淀，在测序电泳时会干扰测序信号，导致这部分碱基无法读清。一般的我们会在分析结果时切掉这部分无意义的数据。通常这也是载体的序列。所以选取测序引物时要使引物3端离开要求测序的起始位置50碱基以上比较合适。而对于PCR产物测序就不可避免使得测序引物区域附近无法读到数据。 14.为什么在测序报告上找不到引物序列？ 有如下几种情况。（1）找不到测序所用的引物序列。这是正常的，因为荧光测序方法采用的是荧光标记了的ddNTP，自动