现代分子生物学第5章概念.ppt

2. T4 DNA连接酶 从T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现和分离，它是T4噬菌体基因的产物，由一条多肽组成，分子量为68KD。 催化两条DNA链的3’-OH和5’-P之间形成磷酸二酯键而把两个DNA分子连接在一起。 T4 DNA连接酶催化反应条件 必须存在Mg2+和ATP 。 最佳pH为7.5—7.6； 温度在37℃时酶活力最高，5℃以下活力显著降低。 由于同时必须考虑DNA的稳定性和粘性末端的退火温度，在进行连接反应时的温度，对平齐末端连接—般采用20一25℃，对粘性末端连接则采用12℃左右。 重组DNA（基因工程/分子克隆）的主要步骤 包括以下四个基本步骤 (1)目的基因的获得； (2)目的基因与载体分子在体外进行连接反应，形成重组体； (3)将人工重组的DNA分子导入能进行正常复制的寄主细胞，从而得到复制； (4)重组体分子的转化子克隆的选择和筛选 基因工程中常用α-互补来筛选重组质粒(蓝白斑筛选重组子的分子机制)，请说明其原理。 很多载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码β-半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为α-肽，载体转化的宿主细胞为lacZ基因型，它表达β-半乳糖苷酶的C-端肽链，当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β-半乳糖苷酶活性，使特异的底物X-gal变为蓝色化合物，这就是所谓的α-互补，而重组子由于基因插入使α-肽基因失活，不能形