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β－内酰胺类抗生素簇特异性抗体制备研究 李廷群 邱蓉 1.材料与方法 1.1 主要材料 1.1.1 试剂 注射用氨苄西林钠（购于华农大校医院） 动物用青霉素 牛血清白蛋白（BSA） 卵血清蛋白（OVA）））） 管 号 试 剂 1 2 3 4 5 6 1000μl/mL牛血清白蛋白溶液（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（mL） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质浓度（μl/mL） 0 200 400 600 800 1000 准确吸取所配各管溶液0.1mL，分别放入10mL具塞试管中，再加入5mL考马斯亮蓝G250蛋白试剂，盖塞，将试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用10mm光径的比色杯在595nm下比色，作出标准曲线。 将合成的抗原稀释到一定浓度后按上法与考马斯亮蓝溶液反应，测定其OD值，并将测定的OD值代入标准曲线中以求出合成抗原中蛋白质的浓度。 1.2.5 抗体的制备 1.2.5.1 佐剂和免疫抗原的混合 将人工抗原慢慢解冻，根据完全抗原的实际浓度取出一定量，使其溶液中至少含有蛋白质100μg，然后加入等量的弗氏佐剂（第1次免疫用弗氏完全佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂），混合物在旋涡混合器上充分振荡混合至W/O状态。 1.2.5.2 动物实验 选择两只健康的Balb/c小白鼠（一只免疫青霉素，一只免疫氨苄青霉素），做好标记后饲养于动物房中，并按下表对小白鼠进行药物免疫。 免疫次数 免疫时间 免疫原 免疫剂量 免疫部位 1 —— 免疫抗原和等量弗氏完全佐剂混合 100μg蛋白质 腹部、腿部肌肉 2 第1次免疫后两周 免疫抗原和等量弗氏不完全佐剂混合 100μg蛋白质 腹部、腿部肌肉 3 第2次免疫后18天 同上 100μg蛋白质 腹部 4 第3次免疫后三周 同上 100μg蛋白质 腹部 5 第4次免疫后三周 同上 100μg蛋白质 腹部 1.2.5.3 血清的制备 用70％的酒精对剪刀和镊子进行消毒，同时用沾了酒精的棉花球对小白鼠的尾部末端进行消毒，用消了毒的剪刀剪下小白鼠尾部的末端，然后用4mL的离心管进行采血，采血后马上进行离心处理，然后把离心后的血液放置在4℃冰箱中静置3个小时，取上层血清分装保存于－20℃冰箱中。 1.2.6 ELISA法检测抗体的抑制性 抗生素间接竞争ELISA法的原理：将抗生素分子和大分子载体蛋白质偶联制得的复合物作为包被抗原吸附于固相载体上，然后加入待测抗生素和相应的抗体，固相载体上的抗生素就和待测抗生素竞争与血清中的抗体反应。待测抗生素含量高，则被结合在固相抗原上的抗体就少，反之，结合在固相抗原上的抗体就多。反应后加入酶标二抗，最后通过底物显色测定OD值。当抗体的量一定时，加入的待测抗生素量越多，与固相抗原结合的抗体就越少，发色反应减弱，抑制率增高。反之，发色反应增强，抑制率降低。 1.2.6.1 包被抗原 （1）分别取一定量的氨苄青霉素－OVA和氨苄青霉素－OVA，用包被液稀释成0.5、1.0、2.0、4.0μl/ml 四个浓度。 （2）将稀释后的抗原溶液以100μl/孔加入到酶标板上，4℃冰箱中放置过夜。 （3）取出，甩干，用PBST洗涤液洗3次，拍干 （4）加入封闭液200μl/孔，水浴中放置3h，甩干后用蒸馏水洗涤3次，然后放置于烘箱中2h。 1.2.6.2 抗血清药效的测定 （1）根据配制药物稀释液。 （2）将动物血清稀释500倍。 （3）先在一块空板（未经包被，用蒸馏水洗涤一次，甩干）里依次加入75μl 原药标液，再在每孔均加入75μl 经稀释（倍比稀释）的血清，37℃温箱中孵育1h，让原药与血清先在空板上充分反应。 （4）把空板中的液体转移到包被板上，37℃温箱中孵育1h。 （5）蒸馏水洗涤3次，甩干，加入酶标二抗（1：6000），37℃温箱中孵育1h。 （6）蒸馏水洗涤3次，甩干，加显示液，37℃温箱中显色15min，加入终止液。 （7）酶标仪测定OD值。 2 实验结果与分析 2.1 免疫抗原紫外分光扫描 （2）氨苄青霉素的扫描结果 从紫外扫描图谱可以看出，合成的完全抗原的图谱与载体蛋白、半抗原的图谱都有所不同，同时，完全抗原最大吸收峰波长与载体蛋白、半抗原的比较也不同，这说明合成的产物是不同于载体蛋白和半抗原的物质，也就是载体蛋白和半抗原的复合物。从图谱上可以看出，氨苄青霉素－BSA的图谱与其它两个图谱差异较大，这说明氨苄青霉素与BSA偶联得比较彻底。而青霉素与－BSA也有偶联，但总体上不如氨苄明显。 2.2 考马斯亮蓝法测定合成抗原蛋白质的浓度 根据图3