遗传病基因突变摘要.ppt

(5) 银染： 利用银离子可与核酸结合的特性，在甲醛作用下银离子还原为Ag，使凝胶中DNA条带显黑色。 ① 电泳完的聚丙烯酰胺凝胶用10％的酒精浸泡5分钟 。 ② 弃酒精，加入1% HNO3 3分钟，不停摇动。 ③ 弃HNO3液 ，用双蒸水清洗两次。 ④ 加入AgNO3 染液 ，染色10-20分钟。 ⑤ 用双蒸水清洗一次。 ⑥ 加入显影液，至清淅的DNA单链电泳条带出现为止。 ⑦ 弃显影液，加入10％的乙酸定影5分钟。 ⑧ 弃乙酸，在双蒸水中浸泡5分钟以上。 ⑨ 用玻璃纸包胶、干燥，观察分析及记录。 结果分析： 正常人样品目的区带有3条：一条双链扩增产物带 ，两条单链带。单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，所以一般形成两条单链带。两条单链带一般在双链带后边。对显性遗传病来说，如有基因突变，则除了原正常单链带，另出现突变带。 泳道1、3、7、8是正常对照 1、用于DNA提取药品和试剂： 2、PCR反应试剂： 　10XBuffer、MgCl2、dNTPs、Taq-DNA聚合酶由所购试剂公司统一提供。 　DNA 模板：正常对照来自实验者的血液样本，基因突变样本来自角膜营养不良症患者，共计２种突变。扩增片段长度为223bp，为角膜营养不良症基因BIGH3第11外显子。 引物序列： Primer F：CTCGTGGGAGTATAACCAGT Primer R：TGGGCAGAAGCTCCACCCGG 3、用于SSCP的药品和试剂： 　　双甲基丙烯酰胺（Bis） 丙烯酰胺 （Acr） TEMED 30%贮存液 Acr 29 g Bis 1 g 溶于100ml灭菌双蒸水中 　　 显影液 Na2CO3 2.96 g 双蒸水加至100ml, 临用时配, 4℃冷藏。 甲醛 临用时加 54 ?l 10%硫代硫酸钠 临用时加 10 ?l 10%乙酸 10%乙醇 1%HNO3 AgNO3 蔗糖 载样缓冲液（loading buffer） 　　　　　　 95%甲酰胺 20 mM EDTA 溴酚蓝 少许 　　二甲苯氰 少许 10%APS（过硫酸胺） 临用时配 五、注意事项 1、SSCP原理和操作简单，不需要特殊仪器，PCR产物变性后无需处理就可直接电泳。通过改变SSCP电泳中的各种条件，如：加入5-10%甘油、5%蔗糖和改变温度或电压等，可将约95%的DNA碱基改变检测出来。 2、SSCP分析的灵敏性与核酸片段大小有关，片段越小，检测的敏感性越高。对于小于300bp的片段，SSCP可发现90%的变异；而大于350bp的片段，则难以发现其中变异。因此小于300bp，尤其是150bp左右的核酸的片段更适合SSCP分析。对于较大的片段，可用相应的限制酶降解为小片段，然后再SSCP分析。 3、凝胶厚度和浓度 SSCP分析一般采用5%-10%的凝胶。浓度不同，突变带的相对位置也有差异。在分析未知突变时，最好采用两种以上的凝胶浓度，以提高突变种类的检出率。凝胶越厚，背景越深，在上样量较多的前提下，尽量是凝胶越薄越好。 4、SSCP需要有大量的正常对照一起分析，不能仅仅只是患者的样本。另外，还必须排除人群中的多态性。 5、硝酸银价格较贵，可回收使用，适当延长处理时间。 6、PCR产物特异性不高时，要增加退火温度，减少退火时间及延伸时间，降低引物和Taq DNA聚合酶的浓度，改变Mg++浓度，一般情况下是减少浓度，减少循环次数。 * 分子医学实验 闫小毅 讲师 电话E-Mail：yanxiaoyi@zju.edu.cn 遗传病基因突变分析（一）多重PCR法检测进行性肌营养不良症（DMD）基因缺失 进行性肌营养不良症(Duchenne muscu