第十四章病毒学实验技术可研报告.docVIP

第三篇 病毒学实验技术 实验学时计划：实验一 实验须知6小时；实验二 细胞培养用水的制备及检验15小时；实验三 组织培养技术20小时；实验四 病毒的分离及其理化性质的测定20小时；实验五 病毒提纯技术15小时。 实验一 实验须知 一、实验室注意事项 1．凡参加病毒学实验的人员均应接种与实验有关的病毒疫苗。 2．实验室内，特别是组织培养操作室，须经常保持干燥、清洁。在进行病毒接种或无菌操作前后，均应用紫外线照射灭菌，必要时可用3～5%的酚或煤酚皂溶液擦拭或喷雾消毒。 3．进入操作室，须先洗净双手并用消毒药水严格消毒；更换拖鞋，戴口罩和帽子，穿消毒的实验服。 4．病毒实验操作完毕后，将所穿戴实验服、口罩、帽子和拖鞋等物，出操作室前须更换；两手须经消毒药水严格浸洗后方能外出。 5．一个接种操作室，严禁同时进行两株病毒株的传种；吸取病毒材料时，勿于悬空吹出或打出。 6．凡沾病毒材料的吸管、试管等器具，须随时投入5%煤酚皂或1%盐酸溶液内，浸泡过夜，或煮沸消毒后才能进行洗涤。 7．凡带有感染性的鸡胚或动物尸体，须立即投入炉内焚化或进行煮沸消毒，或盛入容器内进行高压消毒后，方能携出室外进行处理。 8．工作人员要随时注意安全操作，以免发生事故；如发生意外，应迅速采取有效措施补救。 二、病毒材料收集、运送和保存 （一）材料的收集 分离病毒的成功率与采集材料有密切的关系。采集病料必须在适当的部位和时间内进行，前者与各种传染的发病机理有关，后者常规在疾病早期，因为通常在疾病刚出现时病毒的滴度高。各种病毒感染所采适宜病料参见图1和图2。 由于许多病毒的不稳定性，欲作病毒分离的材料，都应尽快的冷藏。－30℃保存的病毒材料（除少数例外），至少可以活存几个月以上；而－70℃保存的病毒，甚至几年不见毒力降低。有些病毒需在潮湿环境下保存，有的则需干燥环境（如Orf virus）。 对于棉拭子标本，折断放入2 ml pH7.4等渗平衡盐溶液的小瓶内，内含0.2%的明胶或牛白蛋白，青霉素、链霉素每毫升含100 u、100 (g；对于粪便、脓汁、鼻液等分泌物或渗出物，除在等渗平衡盐溶液含高浓度青、链霉素〔1000 u（(g）/ml〕外，还加2.5 (g/ml的两性霉素B(或40 (g/ml的制霉素）；对脑等组织材料可放在50%甘油缓冲液中。标本最好在冷藏的条件下尽快送到实验室。 病料要填写标签、临床病史和初步诊断。 （二）病毒材料的运送和保存 供分离病毒用的材料，要尽快送到实验室。如距离较远，可将熔封的材料容器放入冰筒，加冰块，盖严实后运送。如无法获得冰块时，可用冷水加入氯化铵（NH4Cl）按3：1的比例倒入冰筒内搅拌1-3分钟，使溶解后，再放入熔封的材料容器，封闭瓶口运送。 病毒材料的保存：病毒标本必需及时处理，接种动物或培养，否则应将标准保存在-25℃至-70℃的低温冰箱或-196℃的液氮中。病毒和病毒株真空干燥保存。 长期保存病毒，一般应用下述两种方法： 1．快速低温冰冻：于灭菌悬液中加入灭活的正常动物血清或其他蛋白保护剂，最好再加一些二甲基亚砜（5～10％），并迅速冷冻和保存于―70℃或―196℃。 含病毒的组织材料可以直接低温冰冻保存；先浸入50%的甘油缓冲液盐水中，再行低温保存，效果更好。 2．冷冻干燥：在真空条件下使冰冻的病毒悬液脱水。通常用低温脱水法，并以干燥剂或冷凝法除去凝器内尚未凝结的多余水汽。通常用的的干燥剂有五氧化二磷、硫酸钙、氯化钙和硅胶。 干燥毒种的保护剂，一般应用脱脂牛奶、灭活正常动物血清、饱和蔗糖溶液等。真空干燥时，将病毒悬液与5－10倍量的保护剂混合，分装安瓶，每支0.2～0.5 ml，立即放入事先预冷的－30℃～－40℃酒精中冻结1～2 h，随后迅速置于盛有干燥剂的干燥器内，立即抽气干燥。充分干燥后，打开干燥器取出毒种安瓶，再抽真空并封口。这样冻干的毒种，一般可在4℃冰箱内保存几年至十年以上。 以上冷冻干燥可在真空干燥机里进行，十分方便。 （三）病料的处理 1．咽喉拭子：放入盛有2～5ml Hanks液的容器内，内含2%犊牛血清和相应浓度（200～500 u或(g/ml）的青、链霉素。通过机械震动，并反复冻融3～5次后，以2000 rpm离心10～20分钟取上清液即可。 2．脑、肝、肌肉等器官或组织：充分剪碎后置乳钵中加石英砂（或玻璃砂）研磨，或置组织研磨器磨碎而制成1︰10的悬液，常用稀释液有pH7.2～7.6pH7.2～7.6的肉汤，10%脱脂乳盐水，0.5%乳汉液（乳蛋白-Hanks液），每毫升含有青、链霉素200 u或200 (g。反复冻融3～5次（－20℃下的酒精中迅速冰冻，37℃温水中融化）后，以2000 rpm离心取上清即可。如中性甘油保存的标本，先用生理盐水冲洗后再研磨。 3．鼻液、乳汁、脓汁等分泌物