第10章+++细胞染色体显示和分带技术课件.pptVIP

第10章 细胞染色体显示和分带技术及其应用 体外培养的细胞是研究细胞遗传最便利、最有效的方法和对象，也是揭示培养细胞性状的重要方面。 第一节 性染色质检测 在间期细胞核中，女性X染色质和男性Y染色质均可用特殊染色法显示出来,性染色质检查方法如下: 一、X染色质显示法 女性：X染色质 ：Barr氏体位于间期细胞核内面，呈三角形或半月形小体，易被碳酸复红或硫堇等染料着色 结果：细胞质不着色，细胞核染成紫红色，核内Barr 小体呈三角形/半月形。 二、Y染色质显示法 男性：Y染色质 ：盐酸阿的平染色法 结果：Y染色质呈特别明亮的黄绿色荧光园点，可位于核内任何位置，但多见于中央部位， 第二节 培养细胞染色体显示法 一、原理 显示染色体要选择分裂中期细胞，因细胞分裂处于中期时，染色体的长短和大小恰到好处，是研究染色体的最好阶段。 获得多量的中期分裂相及染色体分散均匀的理想分裂相可采取的措施如下: 1．提高细胞分裂相数 （1）细胞的选择和处理 大多数传代细胞应选择对数生长期的细胞。初代淋巴细胞常用有丝分裂源PHA、ConA等刺激细胞。 （2）阻抑中期分裂 用秋水仙素(Colchicine)，现常用它的衍生物秋水仙胺(Colcemid)来破坏细胞有丝分裂中的纺锤丝，以发挥阻抑分裂中期的作用。由于DNA合成并无干扰，因此随时间延长可截获很多中期分裂相，一般的用量：秋水仙素0.04～0.8mg/L培养液，秋水仙胺0.004～0.08mg/L培养液。作用时间为2～6小时。 2．促染色体分散措施 （1）低渗处理 一般用0.075mol/L，在37℃水浴中将上述细胞处理20～40分钟，可使细胞体积胀大，染色体松散。 （2）固定 常用醋酸甲醇(1:3)混合液，用时现用现配。 显示染色体方法很多，以下几种方法较为常用。 二、传代细胞染色体检查 一、原理：秋水仙碱可使细胞停止在分裂中期，染色体长短恰倒好处。 二、方法： 细胞类型：传代细胞系，外周血LC，羊水，绒毛细胞等 方法：秋水仙素? 低渗?固定?染色?镜检 第三节 染色体结构显示和检测 一、染色体显带原理和种类 二、染色体显带方法要点 三、原理 四、常用染色体显带法 五、姐妹染色单体分化染色 一、染色体显带原理和种类 （一）原理 染色体显带是沿着整个染色体的长轴，能显现出着色深浅不同。 横行走向的带(Band)经特殊染色后，易着色的阳性带(Positive Band)为含有A-T多的染色体节段，相反，G-C多的则不易着色，为阴性带(Negative Band)。有报道，已被定位的正常基因和异常基因绝大部分都在阴性带区。人们推测，看家基因在阴性区带，人染色体能显示出近2000个G带。 （二）种类 染色体显带是指沿着整个染色体轴能出现着色深浅不同的横纹。根据显带方法不同可分为：用奎吖因(QM)、阿的平(QD)荧光染色的带，称“Q”带；用Giemsa染色显带称“G”带；用Giemsa染色显示异染色质部分称“C”带；用特殊方法处理后，显现出与Q带和G带相反的带型称“K”带等。目前，Q、G和C三种带型较为常用，其中G带更为多用。 二、染色体显带方法要点 “老化”处理：将染色体制片后存放3~10分钟或86℃干燥20～30分钟 显Q带法：用奎吖因(QM) 或阿的平(QM)染色显带 Giemsa显G带：胰酶消化? Giemsa染色显带 显C带法 ：在预热至65℃的5%Ba(OH)2液中15分钟 ?Giemsa染色15分钟显带 注意：1、标本片老化处理很重要；2、胰酶浓度和消化时间要事先熟知，消化要充分但不能过度；3、中期分裂相要多而均匀，稍长一些为佳 1．中期染色体 为了获得满意的显带效果，需制备质量好的中期染色体标本，即须达到以下要求：①长度适宜，一般稍长一些，能显出更多的条带，这与加入秋水仙素的浓度和作用时间有关，要控制好。②染色体分散均匀无重叠，这与低渗有关，低渗不足染色体易发生重叠，过度易流失。③无严重单体分叉。 2．特殊处理 中期染色体标本显带效果的提高要经三个步骤： （1）标本片应先放置一段时间，称“老化”处理，以3～10天为宜。 （2）显带染色前要将标本加温预处理利于显带，预处理后的标本不必再老化。常用80℃干燥20～30分钟。 （3）胰蛋白酶消化较好(比用NaOH、尿素等好)。 三、常用染色体显带法 1．显Q带法 （1）将标本片于pH6.0缓冲液中浸5～10分钟后，再转浸入用Soresen氏缓冲液(pH6.0)配制的0.2%的QD或QM染液中染色5～10分钟(见表12-3-1)。 （2）用pH6.0的磷酸缓冲液漂洗2次，每次5分钟，于玻片上滴加1～2滴新鲜缓冲液，加盖片。 （3）在荧光显微镜下观察。 2．胰酶一G