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虎杖PcPKS1基因RNAi载体的构建 　　摘要：虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）是富含芳香族聚酮化合物的药用植物，Ⅲ型聚酮合酶（Polyketide synthase，PKS）对芳香族聚酮化合物的合成起重要作用。为了研究虎杖Ⅲ型聚酮合酶基因PcPKS1的功能，分别选取PcPKS1基因的编码区保守序列（574 bp）和3′端非编码区特异序列（209 bp）作为干扰片段。将选定的干扰片段，分别以正向和反向插入到pYLRNAi 载体中GUS基因内含子的两侧，以形成hpRNA表达盒，成功构建了以组成型CaMV35S为启动子，以潮霉素抗性为筛选标记的RNA干扰表达载体pYLRNAi-CDS和pYLRNAi-UTR，并将载体导入农杆菌LBA4404中。 　　关键词：虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）；III型聚酮合酶；查尔酮合酶；RNA干扰；转基因 　　中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）09-2255-05 　　虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.）为蓼科蓼属多年生草本植物，也是富含芳香族聚酮化合物的药用植物[1]。聚酮化合物是一大类抗菌、抗肿瘤、抗寄生虫并具免疫抑制剂活性的天然产物。聚酮化合物通常在聚酮合酶（Polyketide synthase，PKS）的作用下生成。聚酮合酶可以分为3类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型PKS[2]，其中III型PKS即查尔酮合酶（Chalcone synthase，CHS）超家族主要分布于植物界。自从1983年第一个植物Ⅲ型聚酮合酶基因家族成员查尔酮合酶基因被克隆以来，植物III型PKS不断被克隆和鉴定，序列分析表明他们之间氨基酸序列相似性在60%以上，编码约400个氨基酸的蛋白质[3]。Ma等[4]从虎杖中克隆得到一个III型PKS基因PcPKS1，该基因含有3个内含子，BLAST分析发现，PcPKS1与其他植物来源的PKS基因具有80%～99%核苷酸序列的相似性[5，6]。体外酶活试验研究表明，PcPKS1是一个具有查尔酮合酶（CHS）和苯亚甲基丙酮合酶（BAS）活性的双功能酶[5]，但PcPKS1在植物体内的生物学功能研究鲜有报道。 　　RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由靶基因同源双链RNA引发，在动植物和真菌中普遍存在序列特异的转录后基因沉默现象。按双链RNA（dsRNA）产生途径将RNAi技术分为多种，其中以具有反向重复序列的hpRNA载体结构在转录过程中形成稳定的dsRNA抑制基因表达的效率较高[7]。RNAi技术已成为功能基因组学研究、动植物性状改良和疾病基因治疗的强有力工具[8，9]。 　　虎杖富含芳香族聚酮化合物，存在多种Ⅲ型PKS基因来合成这些复杂多样的化合物，深入研究虎杖中聚酮类化合物的生物合成与代谢途径将为人们更合理地利用虎杖的药物资源和基因资源提供参考。本研究从反向遗传学入手，选取位于PcPKS1基因的编码区保守序列（574 bp）和3′端非编码区特异序列（209 bp）为目标序列，以载体pYLRNAi作为骨架载体，分别构建能形成hpRNA结构的RNAi表达载体，为进一步鉴定PcPKS1基因的生物学功能和虎杖功能基因组学研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 材料 野生虎杖植株由广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心提供。 　　1.1.2 菌株和载体 根癌农杆菌LBA4404和潮霉素抗性的双元表达载体pYLRNAi由华南农业大学植物基因组学与生物技术重点实验室提供。 　　1.1.3 试剂 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、pMD18-T载体购自TaRaKa公司。总RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒和凝胶回收试剂盒购自Tiangen公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 虎杖叶片总RNA的提取及反转录 以野生虎杖叶片为材料，采用Trizol法提取总RNA，用cDNA第一链合成试剂盒将总RNA反转录成cDNA备用，按试剂盒说明书进行操作。 　　1.2.2 干扰片段的选择 根据PcPKS1基因的保守区和特异区序列分别设计2个干扰片段（图1），用于后续2个RNAi载体的构建。将NCBI中PcPKS1基因（登录号：EF090266）的序列进行Blast比对，查找PcPKS1基因的保守区域，选择编码区605～1179 间长574 bp的序列作为第一个干扰片段，简写为CDS。在3′端非编码区选取长209 bp的特异序列作为第二个干扰片段，简写为UTR。 　　1.2.3 引物设计 以表达