反向模式―强阳离子交换―反向模式二维色谱法测定人血浆中甲氨蝶呤浓度.docVIP

反向模式―强阳离子交换―反向模式二维色谱法测定人血浆中甲氨蝶呤浓度 　　摘 要 建立了反向模式-强阳离子交换-反向模式（Reversed phase-strong cation exchange-reversed phase）二维色谱平台测定人血浆中甲氨蝶呤浓度的方法。样品经三氯醋酸沉淀蛋白后，在ASTON C8一级柱（100 mm × 4.6 mm， 5 μm）上完成初分离，通过六通阀切换，经ASTON SCX中间级（20 mm×4.6 mm， 5 μm）二次分离和储存，在SAC C8二级柱（100 mm × 4.6 mm， 5 μm）上完成最后分离， 并测定。一级柱流动相为10 mmol/L醋酸铵-乙腈（90∶10， V/V， 以醋酸调至pH 3.8），流速为1.0 mL/min;中间级流动相为10 mmol/L H3PO4溶液（pH 3.0）;二级柱流动相为50 mmol/L醋酸铵-乙腈（87∶13， V/V， 以醋酸调至pH 5.2），流速为1.2 mL/min，检测波长 306 nm。单次分析时间4 min，线性范围0.09～5.1 μmol/L，检出限为0.005 μmol/L，日内RSD小于1.8%，日间RSD小于3.5%，相对回收率99.1%～101.25%，绝对回收率85.7%～86.4%。本方法简便、准确，适合日常血药浓度监测和药代动力学研究。 　　关键词 二维色谱; 甲氨蝶呤; 高效液相色谱法 　　1 引 言 　　甲氨蝶呤（MTX）为二氢叶酸还原酶抑制剂，通过竞争性抑制二氢叶酸还原酶，阻止二氢叶酸还原为四氢叶酸，推迟和阻碍DNA 和RNA 的合成，发挥抗肿瘤作用，被广泛用于治疗急性淋巴细胞白血病等恶性肿瘤疾病。临床上采用大剂量甲氨蝶呤联合甲酰四氢叶酸钙（ Calcium folinate，CF） 解救疗法治疗儿童急性淋巴细胞性白血病，由于该疗法都是超常规大剂量静脉滴注， 易产生严重的甚至致命的毒性反应， 例如肾衰竭?骨髓抑制、肝损害、胃肠道反应、皮肤黏膜反应等， 且剂量与血药浓度个体差异大，必须开展MTX血药浓度检测lt;supgt;[1]lt;/supgt;。测定甲氨蝶呤的方法现主要有荧光偏振免疫法（FPIA）lt;supgt;[2]lt;/supgt;和高效液相法[3～8]。荧光偏振免疫法需要进口免疫试剂盒，因价格高而限制了在临床使用;高效液相具有专一性强、准确度高的特点，大多数文献都是基于一维色谱与不同的检测器联用，如紫外[3～5]、荧光lt;supgt;[6]lt;/supgt;、质谱lt;supgt;[7，8]lt;/supgt;等，其中，液相色谱-质谱联用法灵敏度高，分析速度快，但预处理过程复杂，且购置仪器成本较高。本研究采用二维色谱平台，加上压缩控制流路抑制大体积进样和二维色谱死体积大而造成的峰展宽，运用SCX中间级对色谱网络进行串联修改，实现了样品的大通量快速检测，显著减少了人为干预度和单次分析时间，适用于大样本临床药物浓度测定和药代动力学研究。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　RP-SCX-RP二维色谱平台：3个LC-20A泵、CBM-20A色谱控制器、SIL-20A自动进样器（改装500μL进样环）、DGU-20A自动脱气机、SPD-20A紫外检测器、2个FCV-12AH六通阀，以上各组成单元均购自日本岛津公司;FLC2420柱温箱、ASTON C8一级色谱柱 （100 mm×4.6 mm， 5 μm）、ASTON SCX中间级 （20 mm×4.6 mm， 5 μm）、SAC C8二级柱为 （100 mm×4.6 mm， 5 μm），均购自长沙ANAX分析仪器有限公司;电子天平;PHS-3S PH计（上海精科），XW-80A涡旋混合器（上海青浦西仪器厂）;高速离心机（杭州奥盛仪器有限公司）。 　　MTX对照品（中国药品生物制品检定所）;甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）;乙酸铵（美国TEDIA公司）;乙二醇、三氯乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）;去离子水由美国Millipore 纯水机制备;患者血清取自中南大学湘雅医院小儿科。 　　2.2 对照品溶液和质控血清样品的制备 　　取MTX对照品适量，准确称定，用甲醇溶解和少量DMF助溶，并定容至25 mL， 制成51.54 μmol/L贮备液。取上述标准品储备溶液适量，分别加乙二醇稀释，制成各标准工作溶液。用空白血清和MTX贮备液分别配制浓度为0.0879， 0.2474， 0.6185， 1.546， 3.092和5.154 μmol/L的MTX系列标准血清样品。同法配制浓度为0.2474和3.092 μmol/L的质控血清样品，分装于1.5 mL塑料离心管中，置 Symbolm