NgAgo-gDNA基因编辑技术(林程忠复能基因).pptVIP

复能基因 FulenGen GeneCopoeia 复能基因 FulenGen www. TM GeneCopoeia Expressway to Discovery NgAgo-gDNA 基因编辑技术 报告人：林程忠 2016-05-24 韩春雨 1974 年生 河北科技大学副教授 2016 年5月其科研团队 在nature biotechnology 发表《DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute》 作者介绍 NgAgo-gDNA 概述 NgAgo-gDNA：一种通过5’端磷酸化的单链DNA 介导NgAgo蛋白对靶向基因进行修饰的技术 NgAgo（Natronobacterium gregoryi Argonaute）是在格氏嗜盐碱杆菌中发现的一种DNA介导的双链核酸内切酶 NgAgo NgAgo-gDNA 与 Crispr-CAS9 特点比较 NgAgo-gDNA Crispr-CAS9 5-P-ssDNA 介导 sgRNA 介导 ssDNA无特殊二级结构要求，除靶序列一致的碱基无需其它碱基参与 sgRNA由tracrRNA和crRNA组成，需求固定的二级结构 结合靶序列23-25bp 结合靶序列19-21bp 无需PAM区 需要PAM区 NgAgo蛋白 由887个氨基酸组成 CAS9蛋白 由1368个氨基酸组成 可在哺乳动物细胞水平进行基因组编辑 可在哺乳动物细胞水平进行基因组编辑 NgAgo-gDNA 的优势 1，设计更加灵活 由于NgAgo-gDNA系统无PAM要求，5p ssDNA设计相较sgRNA更加 灵活 2，理论上精确性会比Crispr-CAS9 高 NgAgo-gDNA识别靶序列的长度会比Crispr-CASE9长约4个碱基，另外DNA-DNA duplex的特异性比RNA-DNA duplex高,所以理论上精确性会更加高。 3，对向导序列-靶序列错配容忍度低 5p ssDNA上任何一个碱基的变换都会降低NgAgo 73%-100%的切割效率,如有连续三个碱基错配则使NgAgo完全没有切割效率。 (d ) T7E1 assay of G10 guide with indicated nucleotide mismatches (marked in red). 4，脱靶率低 1）NgAgo 只结合5P ssDNA，而细胞内没有检测到5P ssDNA。 2）293T细胞内NgAgo蛋白表达24小时后，结合5P ssDNA能力会明显下降。 3）NgAgo 遵循‘one-guide-faithful原则，即，NgAgo 蛋白在表达过程中，结合上5p ssDNA后，37℃条件下不会与其它5p ssDNA发生交换。 5，针对富含GC的靶序列，NgAgo系统比Cas9系统切割效率更高。 Comparison of the efficiency between NgAgo-gDNA system and Cas9-sgRNA system in cleaving the human which (G+C)-rich sequences at HBA2 and GATA4 genes 附录： 复能基因 FulenGen GeneCopoeia 复能基因 FulenGen