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蛋白质组学 浙江大学 生命科学学院 江 辉 第三章 生物质谱技术 蛋白质组学研究思路和技术 前言 1）质谱技术的特点 质谱仪是一个用来测量单个分子质量的仪器(Thompson)，但实际上质谱仪提供的是分子的质量与电荷比(m/z or m/e)。 质谱法是一强有力的分析技术，它可用于未知化合物的鉴定、定量分析、分子结构及化学特性的确定等方面。 所需化合物的量非常低：10-12g, 或10-15 mole； 应用范围广：1） 有机质谱法：生物、医药、聚合物、法医和环境等方面；2） 无机质谱法： 地球化学，地质矿产和无机元素分析鉴定等方面。 质谱图意义 A: 离子的相对强度(Y axis) B: 离子的质量与电荷比(m/z, X axis) C: 质谱图中最强的峰称为基峰(base peak) D: 相对于特定的检测器时称为峰的绝对强度 E: 所有质谱峰对应的是离子电信号强度和离子应在的m/z位置而非真实的离子强度和离子. F: 棒状谱(centroidal peak) G: 高斯峰(gauss peak) 准确度(accuracy)：ppm (part per million) 稳定性(stability)：仪器在一定时间间隔内某离子的m/z测量值的变化。 质量范围(mass range)：仪器可以检测离子 m/z 的范围。 动态范围(dynamic range)：在动态范围内, 样品量与仪器输出的信号应成正比例关系。 基本原理简介 质谱仪包含了五个主要的系统： 将不同型态样品导入质谱仪的进样系统(sample introduction) 使样品游离成气态离子形式的离子源系统(ionization source) 依质荷比(m/z : mass to charge ratio)不同分离各个样品离子的质量分析仪(mass analyzer) 探测各样品离子探测器(detector) 将离子探测信号进行转换的数据处理系统(data system)。 基本原理简介-概念 质谱(MS)是利用离子化的带电物体在电场中的移动来探测出分子的重量。 所要测的蛋白质样本先做气相的处理且离子化，再利用荷质比(m/z)、也就是分子量对其所带电荷的比值来做分离的动作，而其所带的电荷有可能是正的也可能是负的。 大部分的质谱可被用在两个方面: 1.???? 待测物的组成 2.???? 待测物的结构 质谱与蛋白质 对于蛋白质的“鉴定”，较早期的方法是利用Edman sequencing，或是二维凝胶电泳技术。 但利用这些技术花费的时间较长；如Edman sequencing，一天大概只能鉴定出一个或二个peptides。 对于研究蛋白质组学的研究员来说，要用这些传统的方法来解出自然界中成千上万的蛋白质结构，实在是天方夜谭。 质谱(Mass spectrometry)的发明，带给了研究蛋白质的人无限的希望。 但从前质谱仅运用于小分子，对于像蛋白质这样大的分子是一筹莫展；因为 在进行质谱分析时，必须将分子气化及带上电荷。对于较小的分子而言，并不是相当困难，然而对于大的生物分子（如蛋白质分子），要将分子气化及帶电，同时不能伤害分子的完整性，非常不容易。 1960~1980，科学家发展出许多方式，尝试将生物巨分子从液相游离化成为气相分子，例如比较早期的化学游离法、或是电浆游离法。但是这些方法只能应用到10kDa以內的分子，对于动辄数百至数千kDa的蛋白质巨分子来说，还有相当远的一段路要走。 拜2002年的三位诺贝尔化学奖得主所赐，将质谱的技术做了最有效率的使用，且突破了小分子及固液相的限制，成功的运用这种技术于蛋白质的研究上。 他们是： John B. Fenn; Koichi Tanaka; Kurt Wüthrich 目前有两种做法能使得蛋白质转变为气态离子而不会改变其结构与形态。 由John B. Fenn所发展的方法是运用一个很强的电场将试样喷洒出去(ESI)，而产生一个个带电荷并能自由飞翔的离子。 运用一个强烈的激光脉冲，在适当的条件下(视能量，与试样的结构和化学环境而定)运作，试样可接受激光脉冲的能量而被释放成为自由的离子 (MALDI)，由 Koichi Tanaka最先提出的技术。 基本原理简介-电离（Ionization） 质谱进行分析时，首先要做的就是离子化(ionization)，也就是将待测物处理过后产生气相的离子，并带有电荷。 软电离：保持分子的完整性。 两种最有效的测定蛋白质质谱的电离（软电离）方法： MALDI ESI Soft Ionization 电喷雾电离技术ESI （Electrospray Ionisation） 电喷雾电离质谱技术 利用高电压（约3000k伏）将溶于水