培训课件--肿瘤细胞培养.ppt

* 1、光镜直接检查 2、细胞染色检查 3、细胞超微结构的检查 （一）细胞形态学 * 1、光镜直接检查 呈多边形上皮样细胞； 癌细胞失去接触性抑制，呈现重叠生长。 可见细胞重叠层上有折光度强的圆形细胞。这些特点可与正常上皮细胞区分，转化细胞可出现与癌细胞重叠生长相似的特点。 * 2、细胞染色检查 见正常细胞鉴定，除Giemsa染色外，可用瑞氏结晶紫等染色 癌细胞呈多边形，排列不规则，细胞重叠。细胞核大，核浆比例增大，深染突出、不规则，可见异常分裂象。有的上皮样转化细胞有相同特点。 * 3、细胞超微结构的检查 细胞核大，不规则。胞浆内如观察到桥粒、张力原纤维等为上皮细胞的特点，观察到分泌颗粒是腺细胞特点，如有神经分泌颗粒是神经内分泌细胞特点。细胞超微结构检查对于鉴定细胞系的组织来源和细胞恶性特点有重要意义。 * （二）染色体异常 癌细胞是异倍体，存在染色体缺失、重排和移位等异常。 染色体显带技术可用于检查和鉴别正常细胞和恶性细胞染色体差异。此技术是用特殊技术将染色单体上着色出深浅带（band），显示染色体的结构。 * （三）体外生长异常 癌细胞（或转化细胞）体内外无控制增殖是恶性细胞的特征。癌细胞丧失正常细胞接触性抑制、停泊依赖等生长特点，表现为增殖加速，生长呈过饱和密度，在软琼脂上形成集落等不正常生长特点。通过以下实验，对于鉴定恶性生长有重要意义。 * 1、生长曲线和倍增时间 培养细胞经历一代（从上一代传代到下一次传代的时间），包括潜伏期、对数期、平坦期三个阶段。通过计数7天细胞，可以记录出生长阶段，绘制出生长曲线，计算出细胞倍增时间。可鉴定癌细胞和正常细胞群体生长增殖速度的差异。 * 癌细胞潜伏期短，对数期生长明显，转化细胞与转化前细胞相比较，可见转化细胞对数期生长速度明显增加。依据生长曲线，可计算出细胞倍增时间。倍增时间短，反映了细胞恶性生长。 * 2、克隆效应（cloning efficiency） 克隆效应也可称为集落形成率（rate ov colohy formation），是检测群体细胞中增殖细胞的比率，可反应细胞系的增殖能力，因此是鉴别肿瘤细胞（或转化细胞）与正常细胞的增殖能力的指标。 * 肿瘤细胞和转化细胞具有较高的集落形成率，通常可达10%以上，正常细胞有较低的集落形成率，仅1%左右。 * 3、放射自显影测定细胞饱和密度 核素放射自显影是用核素电离辐射对核子乳胶感光作用显示核素的分布、定位和定量的方法。嘌呤和嘧啶碱基是细胞DNA合成的前体，标记有放射性核素的碱基加入培养细胞液中，可以渗入到细胞DNA合成，细胞经过洗涤，固定涂乳胶，干燥后，于暗室中曝光，经显影后，细胞可在光镜下检测银颗粒，计算出标记细胞的百分数。由于癌细胞或转化细胞失去接触性抑制，无限制性生长，因此标记指数高。 * 4、软琼脂集落试验 肿瘤细胞或转化细胞，由于膜表面粘蛋白的改变，丧失附着于坚实的支持物上才能生长的特点（停泊依赖），能在软琼脂上（半固体）上生长。因此可以鉴别肿瘤细胞（转化细胞）和正常细胞，是细胞恶性生长指标。 * （四）裸鼠移植瘤实验 将培养的细胞系制成细胞悬液，接种到四周龄的裸小鼠皮下，观察细胞侵袭生长和移植瘤。移植瘤生长后病理检查，观察肿瘤组织细胞特征，与取材病人肿瘤病理比较，以确定肿瘤组织来源。 * 癌细胞和恶性转化细胞形成移植肿瘤，正常细胞不形成 。移植肿瘤标本与病人取材标本细胞形态学相似。虽然细胞经体外培养后，细胞形态可能有所变化，但经动物体内组织再建，可出现原肿瘤的组织细胞学特征。 * 五、细胞系建立和鉴定的小结及讨论 由于肿瘤组织含有多种细胞成分，因此建立的癌细胞系必须明确癌细胞来源，并需证明其组织细胞与来源的个体相同。 * 鉴定所建癌细胞系的恶性特征，对于明确细胞系的性质和应用价值有着重要意义。可以通过密度依赖、过饱和密度、克隆效应、软琼脂上形成集落和生长曲线等方法鉴定其恶性生长。 * 转化细胞是正常细胞在致癌物或致突变因素作用下发生基因异常，细胞获得“不死性”，在体外细胞能够传代50次以上，成为永久性细胞系。 转化细胞系可分为恶性转化和一般转化。恶性转化细胞系相似于癌细胞系，在动物体内有致瘤性和体外失去正常细胞的生长特点，表现为无控制生长。 * 癌细胞系和转化细胞系表现为异倍体和多个染色体异常，可以通过染色体分析和显带技术证明。 随着分子生物学方法的进展，检测技术更加完善，从分子水平上发现细胞系的特征，对癌细胞系和恶性转化细胞系的鉴定更加深入。 * 注意： 当肿瘤组织标本很小，不能用酶消化获取癌细胞时，可以用组织块法进行原代培养。 癌组织中不可避免有已耗竭和坏死的细胞，在酶消化前，应尽可能清除，以免接种后很快溶解破坏，释放出影响癌细胞生长的有害物。 癌细胞系的建立 *