分子生物学实验讲义2010.docVIP

实验一 植物DNA提取 一、实验目的 了解植物DNA提取和纯化的一般方法ml Eppendorf管液氮DNA提取液氯仿/异戊醇（24：1）TE DNA提取液（100ml）： 1mol/l Tris-HCl pH8.0 10ml （pH7.8-8.0） 0.5mol/l EDTA pH8.0 10ml 5mol/l NaCl 10ml 10% SDS 12.4ml 偏重Na2SO3 0.38g dd H2O 0.5mol/l EDTA（500ml）： EDTA Na2 93.05g NaOH 10g d H2O充分溶解后调pH至8.0。 1mol/l Tris-HCl（1000ml）：Tris-HCl 121.1g浓HCl 49mld H2O充分溶解后调pH至8.0。 TE（100ml）： 1mol/l Tris-HCl pH8.0 1ml 0.5mol/l EDTA pH8.0 0.2ml 四、操作步骤 将研钵洗净干燥，倒入液氮预冷。 取适量（g）左右新鲜叶片，加入液氮充分研磨后放入ml提取液的离心管。 65℃温.5小时，期间摇动一次。 冷却至室温加入适量（ml）氯仿/异戊醇（24：1）用力摇匀后，放左右。 平衡后，000rpm离心分钟。 上清液，氯仿/异戊醇（24：1）用力摇匀后000rpm离心分钟加入2倍预冷的酒精，。 ml 70%酒精。 ，，加适量（0ul）TE溶解，-20℃贮藏待用。 五、谈谈本次实验中的得和失，还有些需要改进的地方？一、实验目的 了解限制性核酸内切酶，掌握DNA电泳和酶切的方法。 、实验步骤 在.5ml Eppendorf管中，加入 ul DNA，ul 内切酶Buffer，ul EcoRI，加水定容至0ul。混匀后，放入37℃恒温箱小时。×TAE在三角瓶中配制%的琼脂糖凝胶。在微波炉中将溶液煮沸，待冷却至0-70℃时，ul染色剂，倒入两头封好并插入梳子的胶板内。 . 在电泳槽内倒入适量×TAE。胶凝固后小心拔出梳子。取V（恒压）电泳. 电泳结束后，关掉电泳仪，拔出导线。 . 在凝胶成像系统中记录观测。 、主要试剂配方 6×上样缓冲液： 0.25%溴酚蓝 40%蔗糖 0×TAE（1L）： 六、 观察酶切后DNA。实验三 感受态细胞的制备及转化 一、目的 掌握用CaCl2制备感受态细胞的方法。 二、材料及设备 1、材料 保存于-80℃冰箱的DH5α或DH10B甘油菌 2、仪器 恒温摇床 冷冻离心机 移液枪一套 制冰机 水浴锅 3、器材 离心管 50mL×4个（非常洁净，灭菌） 三角瓶 500mL×4个（非常洁净，灭菌） Eppendorf管 1.5mL×若干（灭菌后使用） 三、试剂 1、LB培养基（灭菌后使用） 胰蛋白胨（bacto-tryptone） 10g/L 酵母提取液（bacto-yeast extract） 5 g/L NaCl 10g/L 用NaOH调pH至7.0。 0.1M CaCl2（灭菌后使用） 0.1M CaCl2+15%甘油（灭菌后使用） 四、操作步骤 1、细菌培养 从平板上挑取大肠杆菌（DH5α或DH10B）单菌落，放到LB培养基中。 在37℃，220 rpm培养10h左右。 从中吸取1 mL培养液到装有100 mL LB培养基的三角瓶中，37℃，220 rpm培养2-3hrs，使其OD600达0.3-0.6。 2、细菌收集 将培养液倒入预冷的50 mL离心管中，置于冰上30-40min。4000 rpm，4 度，离心5min。 3、感受态制备 倒弃上清后，加入15mL预冷的0.1M CaCl2，悬浮菌体，冰上放置30 min。 4000rpm离心5min，弃上清，加入15 ml 0.1M CaCl2悬浮菌体。 4000rpm离心5min，加1.5mL0.1M CaCl2 悬浮细胞。冰浴3小时后使用。冰上放到第二天上午也可使用。 4、感受态保存 将上述感受态细胞分装于1.5 mL Eppendorf管中（100ul/管），加15%甘油，液氮