医学检验实验课讲解.ppt

临床免疫学检查 中国医科大学一院检验科 实验内容： 乙型肝炎病毒(HBV)血清学标志物检查 HBsAg-乙型肝炎病毒表面抗原 HBsAb -乙型肝炎病毒表面抗体 HBeAg -乙型肝炎病毒e抗原 HBeAb -乙型肝炎病毒e抗体 HBcAb -乙型肝炎病毒核心抗体 实验要求： 掌握酶联免疫的检测原理 了解试剂盒的使用 掌握乙型肝炎病毒标志物检测结果的临床意义 实验原理： 酶联免疫检测（ELISA） ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。 它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。 此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。 ELISA是以免疫学反应为基础， 抗原、抗体的反应在固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行， 微孔对蛋白有很好的吸附作用，（试剂盒已经包埋好相应的抗原、抗体蛋白成分） 每加入一种试剂孵育反应后，多余的游离反应物可洗涤除去，从而保证试验结果的特异性与稳定性。 反应过程： 包被：将已知抗体或抗原通过物理吸附结合到固相载体表面使其固相化 抗原抗体反应：加入被检标本和酶标记物，使之与固相抗体或抗原发生免疫反应而被结合固定，经洗涤除去游离的酶标记物 酶促反应：加入酶底物，使之发生酶促反应而显色。 ELISA反应材料： 固相载体：聚苯乙烯或聚氯乙烯 有较强的蛋白吸附性能 酶标记物：标记抗原或抗体的酶常选择 辣根过氧化物酶（HRP） 酶底物： 四甲基联苯胺（TMB） 受酶作用后呈蓝色 ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有特异性。 而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化底物分子发生反应，产生放大作用，使本法具有很高的敏感性。 反应类型 夹心法 间接法 竞争法 捕获法 应用生物素-亲和素系统的ELISA 一)双抗体夹心法 1.将已知抗体包被微量反应板，和待检抗原反应，再加酶标抗体和底物，根据显色反应对抗原进行定性或定量。 2.是检测抗原最常用的方法。 二）间接法 标本中的待检抗体与固相抗原结合后，利用酶标记抗抗体（抗人Ig）进行检测。 是检测抗体的最常用方法 三）竞争法 将待检抗原和酶标抗原与相应固相抗体竞争结合，标本中抗原越多，与固相抗体结合的酶标抗原越少，与底物反应生成的颜色越浅，根据颜色深浅可定性或定量测定。 可用于测抗原，也可用于测抗体 ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。 实验材料： 乙型肝炎病毒检测试剂盒 试剂盒: 微孔反应板（48人份） 酶结合物（6.2 mL *1瓶） 阳性对照（1.0 mL *1瓶） 阴性对照（1.0 mL *1瓶） 洗涤液（40 mL *1瓶） 显色剂A（8.0 mL *1瓶） 显色剂B（8.0 mL *1瓶） 终止液（7.0 mL *1瓶） 封片（2张） 说明书（1份） 定量加样器 微量吸头 滤纸 37℃恒温水浴箱 洗板机 酶标仪 实验准备： 取出试剂盒，室温平衡30分钟 配制洗涤液（1：25倍稀释） 样本血清制备：用真空采血管抽取空腹静脉血5mL，静置15分钟后，以3500转/分, 离心5分钟, 分离血清备用。 实验第一步： 每盒试验需设阳性对照2孔，阴性对照2孔， 空白对照1孔 每孔中加入待测标本50微升 除空白孔外每孔加入酶结合物50微升 封板 置37 ℃恒温孵育30分钟 实验第二步： 洗板 手工洗板：首先弃去孔内液体，分别各孔注满洗涤液，静置2分钟，甩干，重复5次后拍干。 每次洗板要甩干微孔里的残液，避免残余游离酶标记物显色干扰读数。 实验第三步： 每孔先加入显色剂A液1滴（50微升），再加入B液1滴（50微升），充分混匀 封板，置37℃水浴箱孵育15分钟。 实验第四步： 每孔加入终止液1滴（50微升），混匀。 终止液为强酸溶液，使酶蛋白变性，终止酶促反应，故加样时应注意。 目视读数。 目视读数： TMB在酶的作用下呈蓝色， 加入终止液（稀硫酸）后变黄， 反应孔颜色深浅同阳性对照孔颜色比较 颜色相同或接近判定为阳性， 颜色相差区别大判定为阴性。 显色系统： 在450nm波长有最高吸收峰， 通过颜色变化及呈色深浅来推断检测对象的有（无）或含量（定量）。 仪器读数： 酶标仪读数：先用空白孔校零，再用波长450nm（