实验五小鼠单个核细胞分离详解.pptVIP

实验五 小鼠脾单个核细胞的分离 —密度梯度离心法 原理： 根据物理学颗粒沉降原理，不同密度的颗粒在其沉降运动中可因其比重的差别而处于不同的分布位置。利用此原理可设计一定比重的液体界面，将小鼠脾脏中各种不同比重的细胞通过离心沉降而达到使其彼此分离的目的。 原理： 已知小鼠淋巴细胞和单核细胞的比重为1.088左右，而红细胞与粒细胞的比重均大于1.088。因此，若用比重为1.088±0.001的分离液则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集得到脾单个核细胞。 操作步骤： 将2ml小鼠脾脏细胞悬液混匀，然后用滴管沿盛有2ml淋巴细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上。 将该试管置水平式离心机中1800rpm离心15min。 用滴管小心直接插入白色絮状的细胞层，吸出界面层细胞，移入另一试管中。 操作步骤： 离心后的样本各成份在试管中的分布位置如下图： 1.088 1.088 操作步骤： 加入足量生理盐水，用滴管轻轻上下混匀，然后1000rpm离心10min，弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀，然后用生理盐水再离心洗涤1次，弃去上清液后充分摇匀沉淀细胞。 用生理盐水稀释沉淀细胞至0.3ml（约加6滴），混匀。 取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分混匀，用计数板在显微镜下计数，计算出淋巴细胞浓度（个/ml）。 检查细胞活力：取细胞悬液一滴，加入等量锥兰溶液于另一试管中，充分混匀后立即滴一滴细胞悬液于载玻片上，在显微镜下计数100~200个淋巴细胞中着色的死细胞数。 操作注意事项 注意分离液与稀释血的比例，一般以1:2~1:3为宜。 分离时所取的离心速度与时间，因各台离心机的离心半径而异，需事先通过预试验决定。 加入稀释血时应十分小心，注意保护试管内的界面，勿使混淆影响分离效果。 做细胞活力检查时，锥兰染色后应尽快计数完毕，时间过长则细胞活力可能降低。 实验结果记录与分析 通过前后两次细胞计数： 单个核细胞浓度（个/ml） 四大方格细胞总数×10×2 ×103 4 一大方格=1 ×1 ×0.1=0.1mm3 1ul=1mm3 1ml=1000mm3