分子遗传学实验-质粒提取.pptVIP

分子遗传学实验 课程安排 实验一：质粒提取 实验二：质粒琼脂糖电泳检测和转化 实验三：转化后分析 实验四：植物基因组DNA提取 实验五: PCR 技术 实验六：聚丙烯酰氨凝胶电泳 注：最后一次实验课时将所有的实验的报告一起交上，作为试卷存档。 成绩：出勤－60％；实验报告－40％。 实验一、 质粒的提取 LB RB EcoRⅠ HindⅢ NcoⅠ 35S MluⅠ LEA PstⅠ Ter NcoⅠ Gus+Ter HindⅢ 35S NcoⅠ 35S NptⅡ+Ter BamHⅠ BamHⅠ pVS1 sta AvaI(1951) AvaI(2431) AvaI(190) AvaI(820) pVS1 rep ClaI(3255) ApalI(5792) pBR332 bon pBR332 ori ApalI(4700) LB UFD XbaI(12548) RB EcoRⅠ(6686) HindⅢ(1) ActⅠ PstI(12539) NcoI(10276) BamH I(9205) Ubi NcoI(8134) NptⅡ+Ter BamHI(13047) Ter Gus+Ter HindⅢ(12356) PstI(13772) UFD PstI(12344) SphI(12350) EcoRI(14793) BamHI(14793) XhoI(13761) SalI(12542) PstI(9179) PstI(9239) PstI(12889) PstI(13422) UFD-RNAi载体 intron aadA AvaI(6275) ApaLI(4202) Ubi 载体的构建： Sticky Ends/Blunt Ends DNA Ligase Plasmid Cloning Vectors Plasmids are circular, double-stranded DNA molecules that exist in bacteria and in the nuclei of some eukaryotic cells. They can replicate independently of the host cell. The size of plasmids ranges from a few kb to near 100 kb Can hold up to 10 kb fragments Plasmids have an origin of replication, antibiotic resistance genes as markers, and several unique restriction sites. A DNA fragment can be kept indefinitely if mixed with glycerol in a –70 degrees C freezer. 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝； 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。 大多数基因工程使用松弛型质粒。严紧型质粒用来表达一些能使宿主细胞受毒害致死的基因。 质粒类型： 实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色体在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。 各种试剂的作用 EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性，避免质粒被酶降解。 NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的变化；但NaOH易和空气中的CO2发生反应，形成碳酸钠，降低了NaOH的碱性，所以必须用新鲜的NaOH。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS能很好地结合蛋白，产生沉淀。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂。 醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的纳离子而形成了PDS，因为十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自