响应面法优化猪血红蛋白抗菌肽的制备工艺.docVIP

响应面法优化猪血红蛋白抗菌肽的制备工艺 　　摘 要：以猪血红蛋白为原料，利用筛选出的蛋白酶水解制备抗菌肽，以酶解液抑菌率和水解度为指标，通过单因素试验对酶解温度、加酶量和酶解时间3个主要工艺参数进行研究，在此基础上，通过响应面优化酶解工艺，建立数学模型。结果表明，胰蛋白酶最适合水解猪血红蛋白制备抗菌肽，其最佳条件为酶解温度49.72℃、加酶量2852.81U/g、酶解时间5.19h，酶解产物抑菌率的理论预测值89.70%，实际测量值90.32%。可见，利用胰蛋白酶水解猪血红蛋白能够得到抑菌活性较高的酶解产物，且该模型能够较好的预测抗菌肽制备最佳工艺条件。 　　关键词：猪血红蛋白；抗菌肽；酶解；响应面 　　中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）11-0001-05 　　抗菌肽（antibacterial peptide，ABP）是生物体天然免疫防御系统的重要组成部分，多数是一类分子质量小于10kD，带有正电荷，在链长、序列及结构方面具有多样性的两亲性肽类[1-2]。抗菌肽具有抗菌谱广、热稳定性高、安全高效等诸多优点，食物源蛋白抗菌肽的制备成为生物领域的研究热点之一[3-4]。目前抗菌肽的制备方法有：从动植物组织中直接提取法、化学合成法、基因工程法和酶解法。因酶解法具有反应条件温和、过程容易控制等诸多优点，被认为是大批量制备抗菌肽最有前途的方法[5-6]。因酶在剪切肽键时具有一定特异性，当选取的酶解底物不同时，也应选取不同种类的酶进行水解以获得抗菌性。如Pellegrini等[7]用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶酶解牛乳α-乳清蛋白均可以得到抗菌组分，而用胃蛋白酶水解得到的多肽组分则无抗菌性。吴林泽等[8]发现用碱性蛋白酶酶解罗非鱼下脚料所得粗肽组分对金黄色葡萄球菌具有很好的抗菌性。 　　目前，我国生猪屠宰加工产业迅速发展，2012年，我国生猪出栏69628万头，增长5.2%，猪肉产量达到5335万吨，增长了5.6%[9]。猪血是生猪屠宰加工过程中的主要副产物之一，营养价值很高，素有“液态肉”之称[10]，我国猪血资源非常丰富，但利用率低，不超过10%，如被加工成血粉作为饲料添加剂，用于生化制药中血红素、蛋白胨的生产，这些产品附加值低，而大多数作为废弃物直接排出，造成了资源浪费和环境污染[11]。欧美、日本等发达国家将猪血开发成肽类试剂、肽类药物等多种功能食品及食品添加剂，普遍推广，利用率达50%以上[12]。因此，以猪血为底物开发生物活性肽，可以提高生猪屠宰加工企业产品附加值，显示出巨大的市场前景[13]。 　　本实验以猪血红蛋白抗菌肽复合物为研究对象，选取最佳酶类进行水解，并以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用单因素试验和响应面法优化抗菌肽制备的酶解工艺。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　新鲜猪血采自北京资源集团；金黄色葡萄球菌 中国肉类食品综合研究中心检测中心实验室。 　　NaOH、盐酸、乙醇、NaCl（分析纯） 北京化学试剂厂；甲醛溶液（分析纯，质量分数37.0%～40.0%） 西陇化工股份有限公司；中性蛋白酶（枯草芽孢杆菌）、碱性蛋白酶（枯草杆菌）、复合蛋白酶、风味蛋白酶（米曲霉） 诺维信（中国）投资有限公司；胰蛋白酶（胰脏）、木瓜蛋白酶（木瓜）、胃蛋白酶（猪胃） 国药集团化学试剂有限公司；平板计数琼脂、营养肉汤 北京陆桥技术有限责任公司。 　　1.2 仪器与设备 　　SCIENTZ-IID型超声波细胞破碎机 北京久润天诚科技发展有限公司；KDY-9820凯氏定氮仪 北京市通润源机电技术有限责任公司；PB-10型数显酸度计 赛多利斯科学仪器有限公司；GL-20G-II型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；SL502N型电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；202A-0恒温干燥箱 上海和盛有限公司；生物安全柜 新加坡Esco公司；F1-45型恒温培养箱、G154DWS湿热灭菌锅 日本三洋公司；CLW-002中空纤维超滤组件 北京旭邦膜设备有限责任公司；LM-125中空纤维超滤试验装置 北京旭成超滤设备厂；LGJ-30D冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司。 　　1.3 方法 　　1.3.1 酶活力测定 　　采用Folin-酚法[14]。 　　1.3.2 猪血红蛋白的制备[15] 　　屠宰过程中采集新鲜猪血，并迅速加入质量浓度为5g/L的柠檬酸钠抗凝，4℃保存。将新鲜猪血在4℃、8000r/min离心10min，收集下层沉淀，以获得红血球及血浆；并加入同等体积的蒸馏水，超声波细胞破碎辅助溶血20min，然后在4℃、4000r/min离心10min，得到血红蛋白溶液，于4℃保存备用。 　　1.3.3 猪血红蛋白酶解物的制备 　　取