Taqman设计总结.docVIP

一、单重Taqman引物探针设计：（为了确保引物和探针的特异性，最好将设计好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast 中核实一次） 1、探针：探针的设计应该在引物的设计之前 ① 长度：18~35（18~30之间最好、最常见），最长37；太长淬灭效果不好。 ② TM值：Primer Express软件计算出来的Tm值在66~72℃之间（最常见68~70℃），最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5~10℃，GC含量在30~80%（最好40%~70%），因此探针最好是富含GC的保守片段；（Primer Express：Do not expand the Tm range by more than 2 °C from the default range）。 ③ 探针位置：尽可能地靠近上游引物,上游引物的3 端离探针的5 端为1-20bp（一般10个以内），最好是探针的5端离上游引物的3 有1个碱基。 ④ 5端应避免使用碱基G，5 G会有淬灭作用，即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在；如果选择FAM-dye在5端第二个序列也不能为G（G in the second position on the 5 end in FAM dye-labeled probes can reduce fluorescent normalized reporter signal）。 ⑤ 可选：整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。要同时考虑在正反两条链上设计引物与探针。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段，且这个不同的碱基最好在探针的中间，且最好为A或T。 ⑥ Repeating oligonucleotides：a. 避免探针中同一碱基重复过多，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现，即≦3（Avoid runs of identical nucleotides. If repeats are present, there must be fewer than four consecutive G residues.）；b. 避免连续的6个A出现（Consecutive A residues：Avoid six consecutive A residues anywhere in the probe. Consecutive A residues can cause a high No Template Control NTC signal）；c. 避免探针的中间区域含有2个或以上的CC dinucleotides（Avoid two or more CC dinucleotides in the middle of the probe, which can sometimes reduce signal）。 ⑦ 检测探针的DNA折叠和二级结构（最大连续的碱基配对数 4：Maximum number of consecutive base pairings allowed in a primer 4；最大的总的碱基配对数 8：Maximum number of base pairings allowed in a primer 8）：a. 避免自身形成环状发卡结构（Hairpin Loops：If a DNA strand possesses a self-complementary sequence, it may form a secondary structure, often called a hairpin loop. When designing primers or probes, avoid regions that tend to form secondary structures. If secondary structures are present, primers or probes must compete against the complementary strand for binding to the target sequence, which reduces PCR efficiency.），b. 避免自身二聚体形成（Self-Dimers：Primers or probes that possess 3′ complementarity with themselves in the PCR reaction may form another type of nonspecific product, a self-dimer. Nonspecific product formation decrea