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HPLC 培训教程-基础篇 培训内容 RIGOL L-3000系列 培训内容 HPLC的发展历史 ??色谱法 Chromatography 溯源 –100多年前俄国植物学家Tswett 　　分离植物色素时采用的实验方法 –他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带 –Tswett用希腊语chroma 色 和graphos 谱 描述他的实验方法，即现在的Chromatography 色谱法 色谱起源 高效液相色谱及特点 高效液相色谱----HPLC （high performance liquid chromatography） 也叫高压、高速、高分离 高压—压力可达150-300kgf＝14.7-29.4MP ＝2-4千Psi 1大气压＝0.1013MP＝1.033kgf＝14.7Psi 家用高压锅＝0.17Mp（114℃）＝24.65Psi 高速—流速为0.1-10.0ml/min 高效—塔板数可达50000/米，一根柱可同时分离100种成分 高灵敏度—UV检测器灵敏度达0.01ng，消耗样品少。 与经典色谱比较 速度快—分析一个样品在10-30min甚至更少 分辨率高—可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果 灵敏度高—紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检 测 器可达0.1pg 色谱柱可反复使用—用一根色谱柱可分离不同的化合物 样品量少，容易回收– 样品经过色谱柱后不被破坏，可以 收集单一组分或做制备。 HPLC的发展历史 1931 Kohn 分离胡萝卜素 1956 Van Deemter 色谱理论方程 1958 氨基酸分析仪 60年代早期气相色谱 60年代液相色谱 1971 Kirkland，现代液相色谱 2004 UPLC HPLC的分析方法无论在理论上还是实践上仍 处于发展阶段 现代液相色谱 HPLC发展史上的一个重要里程碑是1971年《现代液相 色谱实践》一书的出版，标志着液相色谱进入一个飞速发展的时期。 这一时期，分析化学家们进行了以下几项突破性工作： 色谱柱的改进和完善，主要包括固定相填充微粒粒度的改进和流动相溶剂的选择 仪器方面的改进工作，加入高压泵，缩短了分析时间，提高了分离效率 与计算机联用之后，自动化程度大大提高。 培训内容 HPLC的原理-定义 色谱法：是利用组分在两相间分配系数不同而进行分离 的技术。 固定相：两相中有一相是静止不动的,叫作固定相，色谱柱 流动相：有一相是流动的,称为流动相 Mobile Phase ,流动相又叫 洗脱剂,溶剂—携带样品流过整个系统的液体 色谱法的原理：是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解、分配、 吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时, 使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达 到相互分离 流动相 流动相可以是水，有机溶剂，缓冲盐或混合溶剂 纯水器 HPLC的原理 色谱法分类 HPLC vs GC HPLC的分类-相对极性 按流动相和固定相的相对极性分: –正相色谱 Normal Phase Chromatography 固定相的极性大于流动相 –反相色谱 Reversed Phase Chromatography 固定相的极性小于流动相 ??注意:此分类法仅适用于液相色谱 HPLC的分类 溶质：有机化合物的极性 –分子间作用力 静电引力,偶极力,色散力,氢键力… 综合表现的一种描述 溶剂： HPLC的分类-分离机理 ??按分离过程的机理分: –吸附色谱 Absorption Chromatography 根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离 –分配色谱 Partition Chromatography 分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度 分配系数 不同 –离子交换色谱 Ion Exchange Chromatography 根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱 IC –体积排除色谱 Size Exclusion Chromatography GPC Gel Permeation Chromatography –固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂 GFC Gel Filtration Chromatography –固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液 色谱分类 高效液相色谱图名词术语 基本概念 色谱图和峰参数 色谱图、基线、色谱峰 、峰底 、峰高 、峰宽、半峰宽、峰面积 、死时间、保留时间、相对保留时间、死体积、保留体积、相对保留体积 色谱峰定性 鉴别每个色谱峰 通过比较保留值 通常是保留时间 的方法，找到各色谱峰所对应的组份 大多数情况下用比较保留时间来定性