多酚氧化酶的测定.docVIP

多酚氧化酶的测定 试剂：1、0.02mol/l焦儿茶酚溶液：称0.22克焦儿茶酚溶于100毫升蒸馏水中，现用现配。 2、0.1mol/l碘酸钾：0.3567克碘酸钾溶于蒸馏水，定容至100毫升。 3、0.005mol/l碘液：碘化钾2.5克溶于200毫升蒸馏水中，加冰醋酸1毫升，再加0.1mol/l碘酸钾12.5毫升，最后加蒸馏水定容至250毫升。 4、pH6.0磷酸缓冲液：87.7毫升A+12.3毫升B，用蒸馏水稀释至200毫升。 贮备液A：0.2mol/l磷酸二氢钠（27.6g NaH2PO4·H2O用蒸馏水配成1000ml）。 贮备液B：0.2mol/l磷酸氢二钠（53.65g Na2HPO4·7H2O或71.7g Na2HPO4·12H2O用蒸馏水配成1000毫升） 5、其它：1%淀粉；10%偏磷酸；0.1%抗坏血酸（现用现配） 方法： 1、粗酶提取：称取新鲜样品2克，剪碎，置于研钵中，加入少量pH6.0磷酸缓冲液和少许石英砂，于冰浴中迅速研磨至匀浆，将全部材料用缓冲液冲洗入50毫升容量瓶中，并定容至刻度。在18~20度下每隔3分钟摇动1次，共5次，然后再静置15~20分钟，其上清液即为粗酶提取液（可倾入干洁的三角瓶中备用）。 2、活性测定：取干洁50毫升三角瓶6只（编号），按照下表向各瓶中加入pH6.0磷酸缓冲液、0.1%抗坏血酸、0.02mol/l焦儿茶酚，并向③号瓶及⑥号瓶各加10%偏磷酸。然后将三角瓶置于18~20度水浴或放在室温下使内外温度达到平衡之后，每隔1分钟向各瓶中依次加入酶液2毫升，全部加完后保温3分钟，再按原顺序仍然间隔1分钟向①、②、④、⑤号各瓶加入偏磷酸1毫升（注意：加完2号瓶后应间隔2分钟再加4号瓶），用于终止酶的活性。最后向各瓶中加入1%淀粉溶液3滴作为指示剂，摇匀后用微量滴定管以0.005mol/l碘液滴定，当溶液呈现淡蓝色为止，记录碘液消耗量。 3、结果计算：A多酚 0.44 [⑥- ④+⑤ /2]-[③- ①+② /2] *V1/V2/W/t V1：提取时酶液总量（毫升） V2：测定时酶液用量（毫升） ①、②、③、④、⑤、⑥：测定时消耗碘液量（毫升） t：酶反应时间（分） 磷酸缓冲液 抗坏血酸 焦儿茶酚 酶 液 偏磷酸 备 注 1 4 2 2 测坏血酸氧化酶 2 4 2 2 同上 3 4 2 2 1 空白测定 4 4 2 1 2 测多酚氧化酶 5 4 2 1 2 同上 6 4 2 1 2 1 空白测定 试 剂 瓶 号