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显微技术 马玉堃 野生动物资源学院 2009年3月 * 第六节 透射电子显微镜成像原理 透射电子显微镜是利用透过样品的透射电子成像的。电子枪发射出电子射线，经聚光镜后照射在样品上，电子束和样品相互作用后，经透镜成像、放大，在终屏上形成带有样品信息的图像。经某种方式处理，为我们眼睛所识别。那均匀的电子束是如何和样品作用，变成带有样品信息的成像电子的呢? 一、成像过程 在光学显微镜和电子显微镜中，有四种基本的物理过程参与成像：吸收、散射、干涉和衍射。 1．吸收 光学显微镜成像主要是吸收作用，样品中不同物质的吸收有差别，从而形成图像。而在透射电镜中，样品是“薄膜”样品，吸收是很少的，而且吸收在电镜样品中也是不允许的。因为吸收将伴随着热量释放，薄膜样品受热会烧毁的。 2．散射 在透射电镜中散射是最重要的成像机制。一个高速自由电子打在薄膜样品上后，电子将和组成样品的原子发生散射作用。原子由原子核和核外电子所组成。如果高速电子是和原子核相作用，由于原子核的质量比电子大的多，入射电子与核发生弹性碰撞，即弹性散射。入射电子不损失能量，但运动方向发生较大偏转，如图1—37(a)。 当入射电子与样品中原子核外的一个电子发生碰撞时，因质量相同，相互作用之后，将重新分配能量。快速电子将一部分能量交给核外电子，改变速度大小，同时运动方向也发生改变，产生非弹性散射。此时散射角比弹性散射角度小得多，如图l—37(b)。 散射的强弱可以用“原子散射截面”来表示，它是一个电子穿透单位面积的样品时，受到一个原子散射的几率，用σ表示。弹性散射截面可表示为： 表示，电子受重原子（Z大）弹性散射的可能性大，而快速电子受弹性散射的可能性小。 非弹性散射截面可表示为： 和Z的关系不如弹性散射显著，两者和Z的关系为： 即：电子受重元素比轻元素弹性散射的可能性大。 一个光点发出一束电子，样品是很薄的，如果只有一层原子，我们知道，原子核和电子的大小是10-5-10-6A的数量级，而原子间距是1A或更大些。所以，样品本身对于入射电子来说几乎是完全空的空间。大量的入射电子是直接穿过足够薄的样品，打在荧光屏上，形成一亮的背景。只有那些十分接近样品中原子核和核外电子的入射电子才会发生散射，运动轨道发生偏转。散射角越大，电子在物镜后焦面上离轴越远。当散射角大到一定程度，就会被处于物镜后焦面上的物镜光阑所截(图l—38)。那对应于散射能力大的样品上的一个点的像就是一个暗点。这就是由于电子散射形成的图像反差。 上面讨论的是一个入射电子与一个原子、一排电子和一层原子作用的情况。对于实际样品，入射电子在运动轨道上将和多个原子核及电子碰撞。在运动过程中，所碰到的原子数目越多，被散射的可能性越大，所以总散射量和样品的厚度成正比；同样原子核越大，被散射的可能性越大，总散射量也和物质的密度成正比。即总散射量与样品的质量和厚度的乘积成正比。我们定义质量和厚度的乘积为“质量厚度”。样品各处的质量厚度不同，在荧光屏上就形成明暗不同的黑白图像，叫做振幅反差。 质量厚度的单位是ug／cm2，碳的密度约为2g／cm3，厚度为l00A(10—6cm)的碳膜质量厚度为2ug／cm2。生物薄切片的平均质量厚度在l0ug／cm2左右。 3.干涉 从波动学说来看，一个运动的电子可以看作是一个电子波，它向着电子运动的方向以匀速的并随时间作正弦变化的方式前进。可以把电子和样品的作用，看做电子波经过样品后形成了透射波和散射波。如果物镜光阑让透射波和散射波同时通过，入射电子波又是相干的，则电镜中的像就是这两部分波受透镜场作用并相互干涉后合成的结果。当样品很薄时，散射波相对入射波振幅基本不变而相位有变化。由于物质的原子和电子结构没有两个入射电子在穿过薄样品时具有完全相同的路径，即各电子和样品作用的散射波和透射波的相位差不同，各相位差为π的奇数倍时，两者合成波为极小者；为π的偶数倍时，合成波为极大者。使合成波(干涉波)与透射波在振幅上表现出差别，在最终的像中就会出现亮暗不同的区域，这种反差叫做相位反差。透镜的球差和失焦也会引起相位反差。 相位反差人眼看不到，通过改变物镜聚焦状态，即改变合成波的位相，将相位反差转换为振幅反差为人眼所看。 综上，透射电镜图像的反差由振幅反差和相位反差两部分组成。 (1)振幅反差：由样品的各部分质量厚度不同引起的透射中的电子波强度(振幅)变化所提供。它是在物镜后焦面处用小光阑只让一部分(透射束或散射束)通过，从而形成振幅反差像。对于样品结构细节大小超过10-15A，样品厚度大于l00A的样品反差，主要由振幅反差提供。 (2)相位反差：入射电子是相干的，它们受到样品的散射而产生的相位差，